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Capitolo 5 Analisi dell'esperimento Visualizzazione tabella Well (Pozzetto) Colonna Nome saggio SNP ID saggio Operazione Allele 1 / 2 Colranti allele 1 / 2 Allele 1 / 2 R n Rif pass Richiesta Qualità(%) Metodo Commenti Allele 1 / 2 C T Il nome del saggio SNP valutato per il pozzetto. Descrizione Il numero di ID del saggio dell'SNP valutato per il pozzetto. L'operazione assegnata al pozzetto (Non noto, controllo negativo o controllo positivo). Il nome dell'allele associato per l'SNP valutato per il pozzetto. Il nome dei coloranti reporter e quencher dell'allele associato per l'SNP valutato per il pozzetto. Segnale normalizzato (R n ) del colorante reporter dell'allele associato per l'SNP valutato per il pozzetto. Il segnale del colorante di riferimento passivo per il pozzetto. La richiesta di allele assegnata al campione, dove possibili richieste sono: • ● Omozigotico 1/1 – Omozigotico per l'allele 1 • ● Omozigotico 2/2 – Omozigotico per l'allele 2 • ● Eterozigotico 1/2 - Eterozigotico • ■ Controllo negativo • ✕ Indeterminata Il valore di qualità calcolato per la richiesta di genotipo. Il metodo utilizzato per assegnare la richiesta al campione (Auto se assegnato dal software StepOne oppure Manual se applicato da un utente). Commenti immessi per il pozzetto del campione associato. Ciclo soglia (C T ) del campione per l'allele associato per l'SNP valutato per il pozzetto. Colonne indicatori CQ La tabella pozzetti visualizza le colonne per gli indicatori CQ che sono attivati dai dati sperimentali. Se i dati dell'esperimento non attivano un indicatore CQ, il software StepOne non visualizza una colonna corrispondente per l'indicatore. Un ▲ in una delle seguenti colonne indica che il pozzetto associato ha attivato l'indicatore. BADROX Il pozzetto ha prodotto un segnale di riferimento passivo maggiore del limite definito nelle impostazioni di analisi. OFFSCALE Il pozzetto ha prodotto un livello di fluorescenza maggiore di quello misurabile dal Sistema StepOne . NOSIGNAL CLUSTER# PCFAIL SMCLUSTER AMPNC NOAMP Il pozzetto non ha prodotto un livello rilevabile di fluorescenza. Per l'SNP valutato per il pozzetto, il numero di cluster generati dai dati dell'esperimento è maggiore del limite definito nelle impostazioni di analisi. Il controllo positivo non produce un R n per l'allele associato maggiore del limite definito nelle impostazioni di analisi il che indica che l'amplificazione non è riuscita. Il numero dei datapoint nel cluster associato è minore del limite definito nelle impostazioni di analisi. Il pozzetto ha prodotto un R n maggiore del limite definito nelle impostazioni di analisi il che indica possibile amplificazione. Il pozzetto non ha prodotto un R n per l'allele maggiore del limite definito nelle impostazioni di analisi il che indica possibile mancata amplificazione. Note 78 Guida introduttiva al sistema Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System per gli esperimenti di genotipizzazione RISERVATO - Esclusivamente per uso interno AB. Non distribuire.
Capitolo 5 Analisi dell'esperimento Visualizzazione tabella Well (Pozzetto) Colonna Descrizione NOISE SPIKE EXPFAIL BLFAIL THOLDFAIL CTFAIL La fluorescenza di background (noise) prodotta dal pozzetto è maggiore di quella prodotta dagli altri pozzetti sulla piastra di reazione di un fattore maggiore del limite definito nelle impostazioni di analisi. Il Plot di amplificazione per il pozzetto contiene uno o più datapoint incompatibili con gli altri punti nel plot. Il software non è in grado di identificare la regione esponenziale del Plot di amplificazione per il pozzetto. Il software non è in grado di calcolare la linea di base più appropriata per i dati per il pozzetto. Il software non è in grado di calcolare una soglia per il pozzetto associato. Il software non è in grado di calcolare un ciclo soglia (C T ) per il pozzetto associato. Linee guida analisi Per analizzare il proprio esperimento: • Nel caso si utilizzino controlli positivi, verificare anche l'integrità dei controlli positivi: a. Nel menu Group By (Raggruppa per), selezionare Task (Operazione) per organizzare le righe della tabella in base alla loro funzione sulla piastra di reazione b. Verificare che i controlli positivi non visualizzino indicatori (▲) e che la loro fluorescenza normalizzata del colorante reporter (R n ) sia appropriata per il genotipo (ad esempio, se si valuta l'allele 1/allele 1 di controllo positivo, è lecito attendere un aumento significativo dell'R n per la sonda dell'allele 1 e un aumento molto modesto per la sonda dell'allele 2). c. Ripetere il passaggio b per ogni controllo positivo. • Rivedere i dati per i campioni non noti. Per ogni riga che visualizza ▲ nella colonna indicatori, osservare i dati e gli indicatori attivati dal pozzetto associato. • Selezionare le aree della tabella o i pozzetti di un tipo specifico: – Facendo clic sul tasto sinistro del mouse e trascinando attraverso l'area per effettuare la selezione. – Selezionando Sample (Campione), Target o Task (Operazione) nel menu Select Items (Seleziona voci) nella scheda View Table (Visualizza tabella), quindi selezionando il nome del campione, del target o dell'operazione dal secondo menu Select Items (Seleziona voci) per selezionare i pozzetti di un tipo specifico utilizzando lo strumento di selezione pozzetti. • Raggruppare le righe del layout di piastra selezionando una opzione dal menu Group By (Raggruppa per). È possibile restringere o espandere l'elenco sia facendo clic sull'icona +/- posta accanto ai singoli elenchi sia facendo clic su Collapse All (Restringi tutti) o Expand All (Espandi tutti). Note Guida introduttiva al sistema Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System per gli esperimenti di genotipizzazione RISERVATO - Esclusivamente per uso interno AB. Non distribuire. 79
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Guida introduttiva Applied Biosyste
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Premessa Come utilizzare questa gui
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