Applied Biosystems StepOne™ System Real-Time PCR System ...

Glossario
C T manuale
curva di
dissociazione
curva di melting
curva standard
Impostazione di analisi in cui viene immesso il valore soglia e viene selezionato se
utilizzare calcoli con linea di base automatica o linea di base manuale. Il software utilizza
il valore soglia immesso e la linea di base per calcolare il ciclo soglia (C T ).
Vedere curva di melting.
Visualizzazione dei dati acquisiti durante la fase della curva di melting. I picchi nelle
curva di melting possono indicare la temperatura di melting (Tm) del target o possono
identificare un'amplificazione della PCR non specifica. È possibile visualizzare la curva
di melting come reporter normalizzato (R n ) rispetto alla temperatura o come reporter
derivativo (−R n ′) rispetto alla temperatura.
Negli esperimenti con curva standard e curva standard relativa:
[1] La linea meglio adeguata in un plot dei valori C T provenienti dalle reazioni standard
riportate rispetto alle quantità standard. Vedere anche linea di regressione.
[2] Un set di standard contenenti un range di quantità note. I dati provenienti dalle
reazioni di curva standard vengono utilizzati per la generazione della curva standard. La
curva standard viene definita dal numero di punti nelle serie, dal numero dei replicati
standard, dalla quantità di partenza e dal fattore seriale. Vedere anche serie di diluizioni
standard.
delta R n (∆R n )
design wizard
diluente
DNA campione
(10✕)
EFF%
efficienza di
amplificazione
(EFF%)
Abbreviazione per reporter normalizzato baseline-corrected.
Funzione del software StepOne che aiuta nell'impostazione di un esperimento,
indicando le migliori scelte da eseguire dal momento dell'immissione del disegno
dell'esperimento.
Reagente utilizzato per la diluizione di un campione o di uno standard prima di
aggiungerlo alla reazione della PCR. Può essere rappresentato da acqua o da un buffer
(soluzione tampone).
Componente della reazione visualizzato sulla schermata Reaction Setup (Impostazione
reazione). Il software presuppone che il DNA del campione aggiunto alla miscela di
reazione sia a una concentrazione 10✕. Ad esempio, se il volume della reazione è 20 µl,
il volume calcolato del campione per la reazione 1 è di 2 µl.
Vedere efficienza di amplificazione (EFF%).
Calcolo dell'efficienza dell'amplificazione della PCR. L'efficienza di amplificazione
viene calcolata utilizzando la pendenza della linea di regressione nella curva standard.
Una pendenza vicina a −3,3 indica un'efficienza di amplificazione PCR ottimale, del
100%. Fattori che influenzano l'efficienza di amplificazione:
• Range delle quantità degli standard - Per misurazioni dell'efficienza più accurate
e precise, utilizzare un range di quantità degli standard ampio, da 5 a 6 log (da 10 5 a
10 6 volte).
• Numero di replicati degli standard- Per misurazioni dell'efficienza più accurate,
includere i replicati per diminuire gli effetti delle inesattezze relative al pipettaggio.
• Inibitori della PCR - La presenza di inibitori della PCR nella reazione può ridurre
l'efficienza di amplificazione.
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Guida introduttiva al sistema Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System per gli esperimenti di
genotipizzazione
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