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Capitolo 3 Preparazione delle reazioni Preparazione della miscela di reazione Preparazione della miscela di reazione Preparare la miscela di reazione per l'esperimento utilizzando i volumi calcolati dal software StepOne . Il software StepOne determina quali componenti della miscela di reazione utilizzare sulla base delle selezioni effettuate nella schermata Methods and Materials (Metodi e Materiali) (vedere “Rivisualizzazione dell'impostazione della reazione” a pagina 26). Per gli esperimenti di genotipizzazione, la miscela di reazione contiene tutti i componenti eccetto il campione, il buffer o il controllo positivo. Materiali necessari Preparazione della miscela di reazione • Master Mix TaqMan ® Universal PCR veloce (2 ® ), No AmpErase✕ UNG • Saggio di genotipizzazione del metabolismo di farmaciTaqMan ® (20✕) • Acqua priva di DNAse • Provette per microcentrifuga • Pipettatori • Puntali per pipette • Centrifuga PERICOLO CHIMICO. La Master Mix TaqMan ® 2✕ Universal PCR, No AmpErase UNG può provocare irritazione degli occhi e della pelle. L'esposizione può provocare problemi in caso di ingestione o inalazione. Leggere la scheda di sicurezza dei materiali (MSDS) e attenersi rigorosamente alle istruzioni relative alla manipolazione di questa sostanza. Indossare un'adeguata protezione oculare, indumenti e guanti di protezione. 1. Per il saggio SNP, aggiungere i volumi richiesti di ogni componente in una provetta dalle dimensioni appropriate: Volume di reazione Componente Per pozzetto(µl) 24 Rxns. incluso 10% in eccesso (µl) Secco Umido Secco Umido TaqMan ® Universal PCR Master Mix (2✕) 12.50 12.50 330 330 SNP Assay Mix (20✕) 1.25 1.25 33 33 H 2 O, priva di DNase 11.25 0 297 0 Volume totale della miscela di reazione 25.00 13.75 660 363 2. Pipettare la miscela di reazione con cautela su e giù, quindi tappare la provetta. 3. Centrifugare brevemente la provetta. Note 36 Guida introduttiva al sistema Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System per gli esperimenti di genotipizzazione RISERVATO - Esclusivamente per uso interno AB. Non distribuire.
Capitolo 3 Preparazione delle reazioni Preparazione della miscela di reazione Linee guida per la preparazione Per preparare la miscela di reazione per il proprio esperimento, verificare che siano state eseguite le seguenti azioni: • Preparare le reazioni per ogni SNP separatamente. • Includere volume in eccesso nei propri calcoli allo scopo di compensare le perdite che si verificano durante il trasferimento dei reagenti. • Includere tutti i componenti necessari. • Preparare i reagenti secondo le istruzioni del produttore. • Proteggere l'Assay Mix dalla luce, nel congelatore, fino al momento dell'utilizzo. Una eccessiva esposizione alla luce può provocare effetti non desiderati sulle sonde fluorescenti. Prima dell'utilizzo: • Mescolare bene la Master Mix agitando la bottiglia. • Riportare l'Assay Mix in sospensione agitando su Vortex, quindi centrifugare brevemente la provetta. • Scongelare eventuali campioni congelati collocandoli su ghiaccio. Una volta scongelati, riportare in sospensione i campioni agitandoli su Vortex, quindi centrifugare brevemente le provette. Per ulteriori informazioni Per ulteriori informazioni sulla preparazione della miscela di reazione, fare riferimento al protocollo appropriato per i reagenti utilizzati nelle reazioni PCR (vedere “Per ulteriori informazioni” a pagina 34). Note Guida introduttiva al sistema Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System per gli esperimenti di genotipizzazione RISERVATO - Esclusivamente per uso interno AB. Non distribuire. 37
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