Applied Biosystems StepOne™ System Real-Time PCR System ...

Capitolo 3 Preparazione delle reazioni
Preparazione della piastra di reazione
Preparazione della piastra di reazione
Caricare la piastra di reazione con la miscela di reazione riportata a pagina 36 e i
campioni diluiti riportati a pagina 35. Le reazioni vengono aggiunte secondo il layout di
piastra generato nel software StepOne (vedere “Impostazione dei campioni e dei
replicati” a pagina 22).
Materiali
necessari
• Centrifuga
• Piastra di reazione MicroAmp Fast Optical 48-Well
• Pellicola adesiva MicroAmp Optical 48-Well
• Pipettatori e puntali per pipette
Nota: Il Sistema StepOne esegue unicamente materiali di consumo veloci
MicroAmp .
Preparazione
della piastra di
reazione: gDNA
seccato
1. Pipettare 1 µl del campione appropriato (da 3 a 20 ng di DNA genomico purificato)
in ciascun pozzetto di una piastra di reazione ottica a 48 pozzetti.
È necessario che tutti i pozzetti appartenenti allo stesso saggio di genotipizzazione
contengano la stessa quantità del campione o del controllo.
2. Asciugare i campioni per evaporazione a temperatura ambiente in ambiente privo di
luce e privo di ampliconi. (Mentre è in atto la fase di asciugaggio coprire la piastra
di reazione con un tessuto privo di lanugine.)
3. Trasferire 25 µl della miscela di reazione in ogni pozzetto.
IMPORTANTE! Controllare che non si verifichi contaminazione incrociata da
pozzetto a pozzetto.
4. Sigillare la piastra di reazione utilizzando una pellicola adesiva.
5. Agitare su Vortex la piastra di reazione da 3 a 5 sec.
6. Centrifugare brevemente la piastra di reazione.
7. Verificare che il liquido si trovi sul fondo di ogni pozzetto della piastra di reazione.
In caso contrario, centrifugare nuovamente la piastra a una velocità maggiore e per
un tempo maggiore.
IMPORTANTE! Non far sporcare il fondo della piastra di reazione. I fluidi e gli altri
contaminanti che aderiscono al fondo della piastra di reazione possono contaminare
il blocco campione, provocando un segnale di background esageratamente elevato.
Note
38
Guida introduttiva al sistema Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System per gli esperimenti di
genotipizzazione
RISERVATO - Esclusivamente per uso interno AB. Non distribuire.