Applied Biosystems StepOne™ System Real-Time PCR System ...

Capitolo 1 Introduzione
Informazioni sugli esperimenti di genotipizzazione
Riduzione al
minimo della
fluorescenza non
specifica
Lettura e analisi
delle piastre
Nei saggi TaqMan ® , la fluorescenza delle sonde legate non specificamente viene ridotta,
poiché i mancati abbinamenti dei nucleotidi tra una sonda e una sequenza riducono le
possibilità di scissione della sonda. La lunghezza ridotta della sonda comporta il mancato
abbinamento di una coppia di basi con un effetto negativo maggiore sul binding. La
sonda non abbinata non si lega strettamente all'allele, consentendo alla polimerasi del
DNA AmpliTaq ® Gold di spostare la sonda senza separare il colorante.
Il software StepOne esegue la genotipizzazione dei campioni di DNA simultaneamente
dalla piastra di reazione. Primo, il software normalizza la fluorescenza dei coloranti
reporter alla fluorescenza del colorante di riferimento passivo in ogni pozzetto. Quindi, il
software visualizza le intensità normalizzate (R n ) dei coloranti reporter in ogni pozzetto
del campione su un plot di discriminazione allelica, il che contrasta le intensità dei
coloranti reporter delle sonde specifiche per l'allele. Infine, il software StepOne
raggruppa in modo algoritmico i dati dei campioni e assegna una richiesta di genotipi ai
campioni di ogni cluster in base alla loro posizione nel plot.
Nota: L'algoritmo di clustering software StepOne non richiede genotipi quando in un
esperimento è presente unicamente un genotipo.
Note
6
Guida introduttiva al sistema Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System per gli esperimenti di
genotipizzazione
RISERVATO - Esclusivamente per uso interno AB. Non distribuire.