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Capitolo 1 Introduzione Informazioni sugli esperimenti di genotipizzazione Informazioni sugli esperimenti di genotipizzazione Esperimenti end-point Gli esperimenti di genotipizzazione consistono in esperimenti end-point. Negli esperimenti end-point: • I dati vengono acquisiti al termine del processo PCR. • Le reazioni sono caratterizzate dalla quantità del target accumulata al termine della PCR (Saiki et al., 1985). • Il datapoint rappresenta l'intensità normalizzata del colorante reporter oppure dell'R n . È possibile che alcuni esperimenti end-point includano datapoint pre-PCR. In caso affermativo, il sistema calcola il valore del delta R n (∆R n ) attraverso la formula seguente: R n (post-PCR) – R n (pre-PCR) = ∆R n Nota: In questa guida, il termine esperimento si riferisce all'intero sviluppo dell'esperimento, dal disegno dell'esperimento all'analisi dei dati. Dati PCR in tempo reale per esperimenti end-point Il software StepOne fornisce l'opzione dell'acquisizione dei dati in tempo reale sia per gli esperimenti di presenza/assenza sia per quelli di genotipizzazione. Nel caso un esperimento non riesca, i dati in tempo reale forniscono un aiuto importante nella determinazione delle cause. Informazioni sui saggi di genotipizzazione SNP TaqMan ® Un saggio di genotipizzazione rileva varianti di una sequenza singola di acido nucleico, senza quantificazione del target. La presenza di due sonde in ogni reazione consente la genotipizzazione delle due possibili varianti all'area del polimorfismo singolo-nucleico (SNP) in una sequenza target. Ogni saggio di genotipizzazione SNP TaqMan ® consiste in una provetta singola e pronta per l'utilizzo contenente: • Due primer specifici per la sequenza per l'amplificazione del polimorfismo di interesse • Due sonde MGB specifiche per l'allele TaqMan ® per il rilevamento degli alleli per il polimorfismo specifico di interesse Note 4 Guida introduttiva al sistema Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System per gli esperimenti di genotipizzazione RISERVATO - Esclusivamente per uso interno AB. Non distribuire.
Capitolo 1 Introduzione Informazioni sugli esperimenti di genotipizzazione Informazioni sulle sonde MGB TaqMan ® Ogni sonda MGB specifica per l'allele TaqMan ® presenta: • Un colorante reporter alla sua estremità 5´ – Il colorante VIC ® è legato alla estremità 5´ della sonda dell'allele 1 – Il colorante FAM è legato alla estremità 5´ della sonda dell'allele 2 La sonda etichettata con colorante VIC ® dell'allele 1 corrisponde al primo nucleotide interno alle parentesi quadre della sequenza di contesto nel file informazioni saggi (AIF) spedito con ogni ordine. La sonda etichettata con colorante FAM dell'allele 2 corrisponde al secondo nucleotide interno alle parentesi quadre della sequenza di contesto nel file informazioni saggi (AIF) spedito con ogni ordine. Per la sequenza di contesto ATCGATT[G/T]ATCC, la sonda etichettata con colorante VIC ® si legherà all'allele contenente G e la sonda etichettata con colorante FAM si legherà all'allele contenente T. • Un minor groove binder (MGB), che aumenta la temperatura di melting (T m ) per una data lunghezza della sonda, consente il disegno di sonde più corte (Alfonina et al., 1997, Kutyavin et al., 1997). L'utilizzo di sonde più corte produce come risultato una maggiore differenza nei valori della T m tra le sonde abbinate non abbinate e una genotipizzazione più robusta. • Un quencher non fluorescente (NFQ) alla sua estremità 3´, consentendo per il rilevamento della fluorescenza del colorante reporter una sensibilità maggiore rispetto a un quencher fluorescente. IMPORTANTE! Applied Biosystems non consiglia l'uso del colorante TAMRA come reporter o quencher con il sistema StepOne . 5′ Saggio nucleasico La figura qui di seguito rappresenta una descrizione schematica del saggio nucleasico 5´. Durante la PCR: • Ogni sonda MGB TaqMan ® esegue un annealing specificamente alla sua sequenza complementare tra le regioni del forward primer e del reverse primer. • Quando la sonda oligonucleotide è intatta, la vicinanza del colorante quencher al colorante reporter impedisce l'emissione del segnale del reporter. • La polimerasi del DNA AmpliTaq Gold ® estende i primer legati al templato del DNA genomico. • La polimerasi del DNA AmpliTaq Gold ® ( 5´ nucleasica) separa le sonde che vengono ibridate alla sequenza del target. • La scissione delle sonde ibridate alla sequenza del target separa il colorante quencher dal colorante reporter, con aumento della fluorescenza del reporter. Il segnale di fluorescenza generato dall'amplificazione PCR indica quali alleli siano presenti nel campione. Note Guida introduttiva al sistema Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System per gli esperimenti di genotipizzazione RISERVATO - Esclusivamente per uso interno AB. Non distribuire. 5
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