БЕЛОРУССКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ...

Существуют и другие методы определения нуклеотидного состава ДНК
(при помощи бромирования оснований, депуринизации, спектрального
анализа, электрофореза в полиакриламидном геле и др.), но они не нашли
широкого применения в основном из-за высокой требовательности к качеству
исследуемых препаратов ДНК и недостаточной точности.
Более тонким методом оценки генетического сходства организмов
является метод молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот, с
помощью которого определяют число и степень сходства гомологичных
участков в геномах сравниваемых видов. Главным достоинством этого метода
является то, что он впервые позволил провести количественную оценку
родства микроорганизмов. В основе метода лежит способность
денатурированных (одноцепочечных) ДНК в подходящих условиях
реассоциировать, т. е. соединяться с образованием двухцепочечных молекул
ДНК. Для этого ДНК, выделенную из клеток одного микроорганизма,
денатурируют нагреванием. Клетки другого штамма выращивают в среде,
содержащей радиоактивный предшественник ДНК ( 3 Н, 14 С), в результате
включения которого ДНК становится меченой. Из клеток этого штамма
выделяют ДНК, денатурируют ее и смешивают с денатурированной ДНК
первого штамма. Раствор выдерживают при температуре ниже температуры
плавления ДНК. При этом происходит «отжиг», или специфическая
реассоциация комплементарных цепей с образованием двухцепочечных
гибридных молекул ДНК. Оставшиеся после «отжига» одноцепочечные ДНК
удаляют обработкой ДНКазой. Гибридные молекулы можно обнаружить
путем центрифугирования препарата в градиенте CsCl, где они образуют
полосы, занимающие промежуточное положение между «легкими» и
«мечеными» молекулами двуспиральной ДНК.
При аналогичных экспериментах с препаратами ДНК из двух
неродственных бактерий никакой гибридизации не выявляется; после
«отжига» двойные спирали образуются при специфическом спаривании
только тех цепей, которые первоначально были получены из одной и той же
молекулы ДНК.
Однако оценка гомологии на основе метода центрифугирования в
градиенте плотности слишком громоздка для повседневного использования и,
кроме того, позволяет обнаружить реассоциацию только тех
комплементарных цепей, которые обладают очень высокой степенью
сходства. Для измерения реассоциации молекул нуклеиновых кислот был
разработан ряд более простых методов. Все они основаны на том, что
образование двойных спиралей ДНК должно происходить при использовании
двух разных образцов денатурированной ДНК, один из которых помечен
радиоактивным изотопом; необходимо лишь отделение двойных спиралей от
6