la esferocitosis hereditaria y su diagnostico en la practica clinica

de los estromas erierocitaflos, estimación del contenido proteico total de
los mismos, estimación del contenido de espectrina y arriltinina de la mcm—-
brana del hematíe e inmunoblot antiespectrina.
3.ó.I. Preparación de los estromas ericrocitarlos
Partiendo de sangre venosa de casos y controles recogida era EDTA
nolpocásico, como máximo a las ‘48 horas de su obtención y conservando
siempre las muestras a 4QC hasta el momento de procesarías, se prepara-
ron membranas eritrocitarias según se ha descrito previamente 3,29,43,50,
~ Para ello, se desleucotízó a sangre venosa mediante una columna de
celulosa microcristalina en suero salino fisiológico (5SF), y tras lavar ¡os
hematíes 6 ‘eces en 5SF fueron sometidos a lisis hipotónica a 4~G en
20-40 voidmenes de PO 4Na3 5 mM, EDTA 1 m M a pH 8, con fenilmetil—
suilonlífluoride 0,3 mM corno inhibidor de las proreasas cora el
fin de minimizar las protecalisis, centrifigundo a continuación a 0—4QC a
300.000 g durante 15—20 mInutos ce, centrífuga refrigerada Sorvalí R, con
posteriores 2-3 lavados más en la misma solución de lisado hasta que los
estromas eritrocitarlos aparezcan blancos o de aspecto cremoso.
Las membranas obtenidas se repartieron ea, alícuotas de 0,1 ml y
se conservaron congeladas entre —40 y ~70VC hasta su utilización (en los
casos y controles en que ésta no fue inmediata a su preparación) como
máximo al cabo de 1 semana,
3.6.2. Determinación del contenido proteico total
Se determinó la cantidad de proteína total contenida en las mem-
R
branas erisrocitarias obtenidas mediante Bio—Rad 1 Proteira Assay segxan
su procedimiento standard, sobre muestras no diluidas y con albúmina séri-
ca bovina (BSA> como standard pioreico. Al cabo de 5 a 60 mInutos de
la adición del reactivo colorante (contIene ácido fosfórico y meranol) en
proporción 50 a i volúmenes, se midió en especíroforómetro Gllford 260
la densidad óptica a 595 nm