Appunti di Principi-BiolMol CTF - Capitolo3 - Omero

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Schema di sequenziamento a terminazione di catenaDNA stampo asingola elica3’-GGCTAAC5’ 3’3’-GGCTAAC+[ 35 S]dATP+dCTP,dGTP,dTT (dNTP) +DNA PolimerasiIbridazione conIl primerddATP, dNTP ddCTP, dNTP ddGTP, dNTP ddTTP, dNTP-CCG ddA-CCGATT ddG-CCGAT ddT-CCGA ddT-CCG ddA-CC ddG-C ddC-ddC-ddC-CddCA C G TSequenza: 5’-CCGATTG-CC ddG-CCGATT ddGGTTAGCCDirezione dilettura-CCGA ddT-CCGAT ddT
• Le diverse catene polinucleotidicheneosintetizzate migreranno nel gel verso l’anodoin funzione della loro lunghezza e possono esserefacilmente localizzate, poichè radioattive, perautoradiografia. Si possono così evidenziarecentinaia di bande e separare catene chedifferiscono di un solo nucleotide.• Nelle 4 corsie del gel le bande si disporranno inordine di lunghezza dal fondo verso la zona dideposizione.• Dalla successione di tutte le bande presenti nelle4 corsie del gel si può risalire alla sequenza delframmento di DNA usato come stampo.
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Impieghi della PCR• Strategie di
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TemperaturePCR100Melting94 o C500T
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TemperaturePCR10050Melting94 o CAnn
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TemperaturePCR10050Melting94 o CAnn
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Dopo n cicli il miscuglio di reazio
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Fasi della PCR Denaturazione (melti
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• * Si possono usare al posto del
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Nested PCR
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Hot Start PCR
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Sintesi del cDNA
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• L’elettroforesi su gel dei pr
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IMPIEGHI DELLA PCRDiagnosi infezion
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Test geneticoAmplificazionemediante
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PCR-ARMS (Amplification RefractoryM
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PCR-ARMS (Amplification RefractoryM
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PCR-SSCP (Single Strand Conformatio
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PCR-HAD (HeteroDuplex Analysis)•
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PCR-HAD (HeteroDuplex Analysis)
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PCR-DGGE (Denaturation Gradient Gel
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Page 138 and 139: Exact Call ChemistryUp to 99.99% ac
Page 140 and 141: Latest Platforms:Illumina HiSeq:•
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