Appunti di Principi-BiolMol CTF - Capitolo3 - Omero

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Plot di amplificazioneLinea soglia sceltadall’operatoreIn maniera da intersecare lecurve di tutti i campioni nellafase esponenzialeIndica il valoreal di sopra delquale inizial’accumulo diun amplificatoE’ il ciclo della reazione diamplificazione in cui il segnaledi fluorescenza del campione èmaggiore rispetto a quello dellaThreshold
QuantificazioneASSOLUTA i campioni sono quantificati in modoassoluto Necessita di “standard” di cui si conosce la concentrazioneassoluta (utilizzo di una “standard curve”) Per tutti gli “unknowns” devono essere saggiate identichequantità di campioniRELATIVA la quantificazione viene effettuataparagonando i C T Necessita di controlli endogeni (non si utilizza una“standard curve”) Gli “unknowns” vengono “quantificati” paragonando il loroC T con quello del controllo endogeno (-actina, GAPDH).
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Impieghi della PCR• Strategie di
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TemperaturePCR100Melting94 o C500T
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TemperaturePCR10050Melting94 o CAnn
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TemperaturePCR10050Melting94 o CAnn
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Dopo n cicli il miscuglio di reazio
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Fasi della PCR Denaturazione (melti
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• * Si possono usare al posto del
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Nested PCR
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Hot Start PCR
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Sintesi del cDNA
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• L’elettroforesi su gel dei pr
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Overview of ABI SOLiD SequencingChe
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Bead DepositionDeposit 3’ modifie
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SOLiD TechnologyLigation-basedchemi
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Exact Call ChemistryUp to 99.99% ac
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Latest Platforms:Illumina HiSeq:•
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Campi di applicazione delle piattaf
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