Appunti di Principi-BiolMol CTF - Capitolo3 - Omero

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Illumina was founded in April 1998• Illumina sells a number of very high-throughput DNAsequencing systems, DNA sequencers, based on technologydeveloped by Solexa. The technology features bridgeamplification to generate clusters and reversible terminatorsfor sequence determination. The technology behind thesesequencing systems involves ligation of fragmented DNA to achip, followed by primer addition and sequential fluorescentdNTP incorporation and detection.
Illumina sequencing technology• Library preparation: il DNA è frammentato, adenilato,oligonucleotidi adattatori sono legati a ciascuna estremità; iframmenti sono selezionati in base alle dimensioni e purificati.• Cluster amplification: i frammenti di DNA a singolo filamento sonoisotermicamente amplificate in celle di flusso per prepararle alsequenziamento. Le celle di flusso hanno degli oligonucleotidilegati, che si ibridizzano agli adattatori dei frammenti di DNA.Amplificazione del DNA: produzione di copie di DNAcovalentemente legate alle celle. Ogni copia della libreria èamplificata attraverso una serie di estensioni e di amplificazioniisotermiche a ponte. I filamenti “reverse” vengono tagliati edeliminati mediante lavaggio. Le estremità libere dei singolifilamenti di DNA nelle celle vengono bloccati.
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Impieghi della PCR• Strategie di
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TemperaturePCR100Melting94 o C500T
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TemperaturePCR10050Melting94 o CAnn
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Dopo n cicli il miscuglio di reazio
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Fasi della PCR Denaturazione (melti
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• * Si possono usare al posto del
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Nested PCR
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Hot Start PCR
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Sintesi del cDNA
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• L’elettroforesi su gel dei pr
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IMPIEGHI DELLA PCRDiagnosi infezion
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Test geneticoAmplificazionemediante
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PCR-ARMS (Amplification RefractoryM
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PCR-SSCP (Single Strand Conformatio
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PCR-HAD (HeteroDuplex Analysis)•
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PCR-HAD (HeteroDuplex Analysis)
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PCR-DGGE (Denaturation Gradient Gel
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PCR-DGGE (Denaturation Gradient Gel
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Resa della PCRResa effettiva: effet
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Soluzioni per PCR quantitativa Util
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Perché Real-Time?• Misura l'ampl
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Analisi tramite software
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SYBR greenUtilizzauna molecola fluo
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SYBR green Dopo l’annealing dei p
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SYBR green Metodica semplicePossono
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Sonde TaqMan La sonda di tipo TaqMa
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ForwardProbeReverse
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