Appunti di Principi-BiolMol CTF - Capitolo3 - Omero

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• Alla rilevazione per autoradiografia si può sostituire unarilevazione con marcatori fluorescenti di quattro coloridiversi legati all’estremità 5’ del primer. Si incuba il primerdi colore diverso per ciascuna delle quattro frazioni. Altermine dell’incubazione si mescolano le quattro frazioni esi fanno correre in un unico pozzetto. Si otterranno sultracciato bande fluorescenti di colori diversi, cheidentificano la base con cui termina ciascun frammento.Questa modalità ha consentito di mettere a punto metodidi sequenziamento automatizzato del DNA, nei quali sieffettua una scansione del gel con un raggio laser cheeccita i fluorofori e si rilevano e registrano le diversecolorazioni delle singole bande.• Ciò consente di esaminare in un unico gel più campioni,ognuno in una diversa corsia, di identificare per ognicampione la sequenza di diverse centinaia di basi, diparagonare tra loro diversi campioni.
Sequenziamento automatizzato con marcatorifluorescentiConiugando a ciascunddNTPun diverso marcatorefluorescente, èpossibile effettuare lequattro reazioni disequenziamento in ununico tubo da saggioe caricare il tutto insolo pozzetto di gelddAddTddCddG
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Impieghi della PCR• Strategie di
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TemperaturePCR100Melting94 o C500T
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TemperaturePCR10050Melting94 o CAnn
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TemperaturePCR10050Melting94 o CAnn
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Dopo n cicli il miscuglio di reazio
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Fasi della PCR Denaturazione (melti
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• * Si possono usare al posto del
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Nested PCR
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Hot Start PCR
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Sintesi del cDNA
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• L’elettroforesi su gel dei pr
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IMPIEGHI DELLA PCRDiagnosi infezion
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Test geneticoAmplificazionemediante
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PCR-ARMS (Amplification RefractoryM
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PCR-SSCP (Single Strand Conformatio
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PCR-HAD (HeteroDuplex Analysis)•
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PCR-HAD (HeteroDuplex Analysis)
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PCR-DGGE (Denaturation Gradient Gel
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PCR-DGGE (Denaturation Gradient Gel
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Resa della PCRResa effettiva: effet
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