Appunti di Principi-BiolMol CTF - Capitolo3 - Omero

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• Il pyrosequencing ha notevoli vantaggi perchè non necessital’utilizzo di dNTP marcati, ne di ddNTs, e non è necessaria laseparazione elettroforetica dei frammenti.• Il metodo è stato automatizzato e sono stati messi a puntosequenziatori che effettuano le determinazioni su molticampioni in parallelo, utilizzando DNA chip; in pratica in ciascunpozzetto è fissato un frammento di ssDNA. Il succedersi dellereazioni che avvengono contemporaneamentein tutti i pozzetti,il rilevamento, l’analisi e l’elaborazione dei risultati è gestito daun software dedicato, che riporta I dati in pirogrammi od intabulati riferiti a ciascun campione.• Con queste strumentazioni è possibile determinare in pocheore sequenze geniche di milioni di paia di basi.• E’ anche possibile anche effetuare contemporaneamenteun’analisi comparativa di DNA di origine diversa, e rilevare confacilità mutazioni di singole basi.
What is Next-Generation Sequencing?One can sequence hundreds of millions of short sequences(35bp-100bp) in a single run• Illumina/Solexa GA II / HiSeq 2000• Life Technologies/AppliedBiosystems SOLiD• Roche/454 FLX, Titanium• Helicos
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Impieghi della PCR• Strategie di
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TemperaturePCR100Melting94 o C500T
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TemperaturePCR10050Melting94 o CAnn
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Dopo n cicli il miscuglio di reazio
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Fasi della PCR Denaturazione (melti
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• * Si possono usare al posto del
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Nested PCR
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Hot Start PCR
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Sintesi del cDNA
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• L’elettroforesi su gel dei pr
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IMPIEGHI DELLA PCRDiagnosi infezion
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Test geneticoAmplificazionemediante
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PCR-ARMS (Amplification RefractoryM
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PCR-SSCP (Single Strand Conformatio
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PCR-HAD (HeteroDuplex Analysis)•
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PCR-HAD (HeteroDuplex Analysis)
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PCR-DGGE (Denaturation Gradient Gel
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PCR-DGGE (Denaturation Gradient Gel
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Resa della PCRResa effettiva: effet
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Soluzioni per PCR quantitativa Util
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Perché Real-Time?• Misura l'ampl
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Analisi tramite software
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SYBR greenUtilizzauna molecola fluo
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SYBR green Dopo l’annealing dei p
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SYBR green Metodica semplicePossono
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Sonde TaqMan La sonda di tipo TaqMa
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