Appunti di Principi-BiolMol CTF - Capitolo3 - Omero

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PCR-SSCP (Single Strand ConformationPolymorphism)• Il cambiamento di una singola base può causare uncambiamento conformazionale nella molecola di DNA asingolo filamento che può essere facilmente rivelata mediantel’elettroforesi.• Procedura: amplificazione mediante PCR della regioned’interesse (“wild-type” e mutato) denaturazione concalore e formammide dei prodotti della PCR, seguita da unrapido raffreddamento per prevenire il ri-appaiamento deifilamenti elettroforesi su gel di poliacrilammide incondizioni non denaturanti.
PCR-SSCP (Single Strand ConformationPolymorphism)• Visualizzazione delle bande: a) uso di una molecola intercalante(bromuro di etidio o SYBR green II); b) colorazione con nitratod’argento; c) mediante autoradiografia se durante la PCR gliampliconi sono stati radiomarcati utilizzando o primers radiomarcatio dNTP radiomarcati; d) medinate fluorescenza se i primers sonomarcati con fluorofori.• Gli individui che sono omozigoti “wild-type” per il locus genicoche viene analizzato mostreranno due bande distinte nel gel, cosìcome gli individui che sono omozigoti mutanti. Tuttavia, comeconseguenza del cambiamento nucleotidico, i prodotti di PCR deimutanti migreranno con una diversa mobilità. Gli individui chesono eterozigoti mostreranno un “pattern” di quattro bande.
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Analisi della sequenzanucleotidica
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ddNTP
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• Si suddivide quindi la miscela
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Sequenziamento automatizzato con ma
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Le emissioni fluorescenti vengono c
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Campi di applicazione delle piattaf
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