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eação de mPCR foi testada para DNA extraído de 56 amostras de exsudato inflamatório de cabras e ovelhas naturalmente portadoras de LC. O ensaio detectou a bactéria nessas amostras de forma eficiente. Foram utilizados, ainda, iniciadores desenhados para o gene 12S rDNA de Capra hircus e Ovis Áries. Tal produto funcionou como controle interno de amplificação não competitivo, permitindo diferenciar amostras que inibem a reação de PCR daquelas que são verdadeiramente negativas. O uso de mPCR, associado a um método de extração de DNA bacteriano, diretamente coletado de exsudato inflamatório, possibilitou a detecção de C. pseudotuberculosis mais rapidamente e de maneira tão específica quanto por cultura bacteriológica, além da identificação bioquímica de isolados, o qual é considerado, atualmente, padrão-ouro para o diagnóstico da LC. Esse trabalho gerou uma patente (Reagentes, iniciadores, e kit para diagnóstico), depositada em 2007 e mantida pela UFMG (PI ND211), e um artigo científico. PACHECO, L.G.C.; PENA, R.R; CASTRO, T.L.P.; DORELLA, F.A.; BAHIA, R.C.; CARMINATI, R.; FROTA, M.N.L.; OLIVEIRA, S.C.; MEYER, R.; ALVES, F.S.F.; MIYOSHI, A.; AZEVEDO, V. Multiplex PCR assay for identification of Corynebacterium pseudotuberculosis from pure cultures and for rapid detection of this pathogen in clinical samples. Journal of Medical Microbiology, v. 56, p. 480-486, 2007. IV.4.2.2.3 Vacinas A melhor medida da relação custo-benefício contra a introdução ou a erradicação da linfadenite caseosa (LC) em um plantel se baseia na imunização. Além de o tratamento com antibióticos não ser eficaz e ser de alto custo, a necessidade de se obter uma vacina eficiente e protetora contra C. pseudotuberculosis pode ser evidenciada pelos relatos de anos de pesquisa com tal objetivo. Entretanto, as vacinas utilizadas apresentam aspectos relevantes a serem considerados quanto à possibilidade de sua utilização. Nem todas as vacinas licenciadas para ovinos têm, por exemplo, a mesma eficiência para caprinos. Por 100
não se adequarem a todos os casos, normalmente é necessário ajustar o programa de vacinação a cada caso. A ineficácia do processo de imunização pode, ainda, estar associada ao uso incorreto das vacinas pelos criadores. Além disso, o estudo da disseminação da bactéria em rebanhos demonstrou que animais aparentemente sem abscedação são transmissores do patógeno. Vários relatos na literatura sugerem diferentes estratégias que vêm sendo testadas, tais como o uso de bactérias atenuadas, mortas, frações contendo antígenos da parede bacteriana, sobrenadante de cultura bacteriana e uma mistura de componentes celulares com sobrenadante. Todas as preparações, de acordo com tais relatos, ofereceram certo grau de proteção contra infecções experimentais e, até mesmo, naturais; contudo, os níveis de proteção e a gravidade das lesões são variáveis. Com o intuito de se obter uma vacina protetora e mais segura contra a infecção por C. pseudotuberculosis, diferentes estratégias metodológicas vêm sendo testadas em nosso laboratório, como vacinas vivas atenuadas, proteínas recombinantes, vacinas de DNA e busca por antígenos imunodominantes. Nosso grupo de pesquisa, entre os anos de 2003 e 2005, identificou 34 mutantes de C. pseudotuberculosis por meio de mutagênese aleatória, utilizando o sistema de transposição baseado no TNFuZ. O TnFuZ é uma ferramenta genética de descoberta de proteínas exportadas por bactérias Gram-positivas. Baseia-se em um elemento transponível (Tn4001) combinado ao gene da fosfatase alcalina (phoZ) de Enterococcus faecalis, cujas regiões codificadoras do promotor e do peptídeo sinal foram removidas. Uma vez que a fosfatase alcalina está ativa somente quando secretada, a inserção deste transposon em loci gênicos que codificam proteínas exportadas levará a fusões que resultarão em células secretoras de fosfatase e que poderão ser facilmente detectadas pela visualização in vitro do produto de degradação de um substrato revelador por essa proteína. Por meio de seqüenciamento do DNA genômico dos 34 clones selecionados, foram identificados 21 loci que codificam subunidades fimbriais, proteínas de transporte e também proteínas de função hipotética e ou desconhecida, as quais podem, ou não, estar relacionadas à virulência e à patogenicidade desse microrganismo. Devido à escassez de informações a respeito dos mecanismos moleculares de virulência e patogenicidade de C. pseudotuberculosis, a aplicação dessa técnica, que é inédita para o estudo dessa espécie de bactéria, poderá contribuir para a identificação de 101
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