Universidade Federal de Minas Gerais Instituto de Ciências ...

A amplificação de múltiplos loci em uma mesma reação de PCR é uma
estratégia amplamente utilizada para detecção de patógenos, por apresentar uma
série de vantagens que incluem a identificação altamente específica do
microrganismo de interesse com economia considerável de tempo e de reagentes.
Nesse contexto, o nosso grupo desenvolveu uma nova metodologia baseada em
uma reação de PCR multiplex (mPCR) para amplificar, simultaneamente, seqüências
de três genes específicos de C. pseudotuberculosis: 16S rDNA (RNA ribossômico
16S), rpoB e pld - exotoxina fosfolipase D.
O teste de sensibilidade analítica do ensaio de mPCR, quando o sistema
AccuPrime (Invitrogen) foi utilizado para amplificar os três loci de C.
pseudotuberculosis, separadamente, possibilitou a visualização de produtos
amplificados em gel de agarose até uma concentração de 10 fg de DNA genômico
por reação.
O teste de especificidade do ensaio de mPCR foi realizado por meio de
reações contendo DNA genômico de várias linhagens bacterianas,
taxonomicamente, próximas a C. pseudotuberculosis. Os perfis de amplificação
obtidos em gel de agarose permitiram a identificação altamente específica de C.
pseudotuberculosis. A possibilidade de se diferenciar C. pseudotuberculosis de C.
ulcerans e A. pyogenes representou uma grande vantagem do ensaio de mPCR
desenvolvido. Como já discutido, o único trabalho prévio que desenvolveu um ensaio
baseado em PCR para detectar C. pseudotuberculosis não relatou diferenciação
dessa bactéria de C. ulcerans, devido à grande similaridade genética entre essas
duas espécies. Já a diferenciação de Arcanobacterium pyogenes também
representa um resultado significativo, uma vez que esse patógeno está presente em
aproximadamente 5% das amostras de exsudato inflamatório coletadas em
abscessos de caprinos. A reprodutibilidade do ensaio de mPCR foi testada com DNA
extraído de 40 isolados de C. pseudotuberculosis, cuja identificação fora
previamente confirmada por testes bioquímicos. A detecção direta de C.
pseudotuberculosis, por meio da mPCR em amostras clínicas de animais portadores
de linfadenite caseosa, representa uma possibilidade extremamente promissora para
o diagnóstico desta enfermidade, uma vez que o método padrão de diagnóstico
laboratorial (isolamento bacteriano e identificação bioquímica de isolados) é,
significativamente, trabalhoso e oneroso. Foi padronizado, então, no LGCM/UFMG,
um protocolo de obtenção de DNA diretamente a partir desse tipo de amostra. A
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