Universidade Federal de Minas Gerais Instituto de Ciências ...

Comecei, então, a construir a biblioteca genômica de B. subtilis no vetor YAC.
A principal característica desse vetor é sua capacidade de carregar insertos
superiores a 100 Kb, podendo até chegar a 1Mb. Ele é usado, preferencialmente, na
construção de bibliotecas de organismos eucariontes, sendo poucos os relatos
encontrados na literatura, que o utilizam na construção de bibliotecas de genomas
bacterianos. Como o genoma de B. subtilis era estimado, à época, em torno de 4,7
Mb - hoje sabemos que há 4,2 Mb - poderíamos ter uma biblioteca representativa do
genoma com menor número de clones. Além da facilidade de manipular um número
reduzido de clones, a segunda razão da nossa escolha foi evitar a instabilidade de
clones de bibliotecas genômicas da B. subtilis, se usada a Escherichia coli como
receptora, mencionada no parágrafo supra. Como a receptora do YAC é a levedura,
os genes da B. subtilis não seriam expressos, já que a maquinaria de transcrição e
tradução não reconheceria os sinais desse organismo, e acreditávamos que esse
fato contornaria o problema de representatividade das bibliotecas.
Enfrentamos vários desafios para conseguir a construção da nossa biblioteca.
Todas as técnicas teriam que ser implementadas, pois ninguém em nosso
laboratório trabalhava com levedura e com clonagem de DNA de alto peso
molecular. Além disso, o YAC é cópia única, o que dificulta o trabalho de clonagem.
Após um ano de tentativas infrutíferas, conseguimos obter 800 clones
recombinantes com insertos médios de 150 Kb.
Não conseguimos clones com insertos maiores, mas estes obtidos cobriam
mais ou menos 14 vezes o genoma da B. subtilis. Resolvemos então tentar construir
um mapa físico por ordenamento clonal dessa biblioteca, o que era de extrema
importância para o projeto do seqüenciamento do genoma. Esse trabalho resultou
em uma publicação no Proceedings National Academy of Science – PNAS, em que
apresentamos um mapa físico que cobria 98% do genoma apenas com 59 clones.
Esse mapa por ordenamento clonal foi o primeiro e único de B. subtilis; nos poucos
relatos na literatura que utilizaram o YAC na construção bibliotecas de genomas
bacterianos, nenhum outro grupo ordenou os clones para gerar um mapa físico de
alta resolução.
Distribuímos para a comunidade científica que trabalhava com B. subtilis
filtros com todos os 59 clones da nossa coleção ordenada, e com isso o
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