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das BL nos âmbitos laboratorial e industrial. Construiu uma linhagem bacteriana mutante de L. lactis, no qual o gene HtrA foi inativado, capaz de evitar que proteínas heterólogas fossem degradadas. Este artigo foi publicado na revista da ASM Applied and Environmental Microbiology. MIYOSHI, A. ; POQUET, I ; AZEVEDO, V. ; COMMISAIRE, J. ; BERMÚDEZ- HUMARAN, L ; DOMAKOVA, E. ; LE LOIR, Y. ; OLIVEIRA, S. C. ; GRUSS, A. ; LANGELLA, P.. Controlled production of stable heterologous proteins in Lactococcus lactis. Applied and Environmental Microbiology, USA, v. 68, n. 6, p. 3141-3146, 2002. CORTES-PEREZ, N. G. ; POQUET, I. ; OLIVEIRA, M. ; GRATADOUX, J. J. ; MADSEN, S. M. ; MIYOSHI, A. ; CORTHIER, G. ; AZEVEDO, V. ; LANGELLA, P. ; BERMUDEZ-HUMARAN, L. G. Construction and characterization of a Lactococcus lactis strain deficient in intracellular ClpP and extracellular HtrA proteases. Microbiology (New York), Inglaterra, v. 152, p. 2611-2618, 2006 A receptora estava pronta, agora precisaríamos desenvolver o doador para termos um novo sistema de expressão. A idéia subjacente era usar um novo promotor ativado na presença de xilose em nossos vetores de expressão. Uma boa razão para construirmos esses vetores é gerar um produto que possa ser usado em aplicações comerciais e sobre o qual não necessitemos pagar royalties, ou, pelo contrário, possamos recebê-los. Nosso promotor tem a mesma eficácia e a mesma força do PnisA, o melhor e mais usado nos dias atuais. O artigo que demonstra o uso desse novo instrumento, o qual denominamos XIES (xylose-inducible expression system), foi publicado na revista “FEMS”. Publicamos também alguns trabalhos sobre sistemas de expressão em Bactérias lácticas que nos deram embasamento para a construção do nosso sistema. NOUAILLE, S ; RIBEIRO, L. A. ; MIYOSHI, A. ; PONTES, D. S. ; LE LOIR, Y. ; OLIVEIRA, S. C. ; LANGELLA, P. ; AZEVEDO, V. . Heterologous protein production and delivery systems for Lactococcus lactis.. Genetics and Molecular Research, v. 2, n. 1, p. 102-111, 2003. 118
DORELLA, F. A. ; MIYOSHI, A. ; PONTES, D. S. ; AZEVEDO, V. . Expressão e Endereçamento de proteínas heterólogas em Lactococcus lactis.. Revista de Ciências Médicas e Biológicas, Salvador - BA, v. 2, n. 1, p. 123-132, 2003. Estamos começando uma nova fase, a de transformar nosso sistema XIES em sistema seguro para a alimentação, ou seja, “food-grade”, substituindo o cloranfenicol pelos genes xylRAB responsáveis pelo transporte e metabolismo da xilose, para ser usado em linhagens industriais de L. lactis incapazes de metabolizar esse açúcar. Dessa forma, a presença do açúcar no meio de cultivo bacteriano favoreceria apenas o crescimento de espécies de BL, que contivessem o sistema XIES. Para melhor qualidade do produto final, uma linhagem htrA mutante de L. lactis deverá ser construída por meio de eventos de recombinação homóloga dupla, integrando, assim, os dois instrumentos genéticos descritos. Pensamos também em adaptar o nosso sistema para ser usado em linhagens de Lactobacillus que possuam atividades probióticas. A linha de construção de novos vetores será um dos “carros-chefes” do laboratório. Na tentativa de diminuir o estresse oxidativo que sofrem as BL durante os processos industriais, decidimos construir uma linhagem de L. lactis, anaeróbia facultativa, que suportasse melhor os efeitos do oxigênio sobre seu crescimento e sobrevida. Essa característica abre também portas para novas utilizações terapêuticas dessas bactérias e, neste caso, poderiam ser utilizadas como veículos carreadores de nutracêuticos anti-oxidantes para destruir os radicais livres produzidos em radioterapias. O projeto de clonar uma catalase em L. lactis foi inspirado pelo meu colega de doutorado, Patrick Duwat, infelizmente falecido em 1999 de câncer, e nossa equipe tem se dedicado aos estudos dessa sua idéia inicial. A proteção da mucosa intestinal por bactérias probióticas, criadas, artificialmente, para melhorar o desconforto de pacientes tratados com radio ou quimioterapia, e a custo reduzido, seria um avanço terapêutico importante. Acreditamos que o efeito protetor dessas bactérias será diretamente nas mucosas e na microflora intestinal, evitando distúrbios no trânsito intestinal, reduzindo o risco de infecção e, conseqüentemente, o uso de antibióticos. Para entrarmos neste mundo complexo, que constitui o estresse oxidativo das BL, estudamos e publicamos uma revisão a cerca do estresse oxidativo em L. lactis na revista Genetics and Molecular Research. Em seguida, clonamos e expressamos 119
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