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mapeamento de genes de B. subtilis, que necessitava de meses a anos pelos métodos clássicos, era feito no máximo em três dias; muitos laboratórios confirmaram a localização dos seus genes de interesse no cromossomo dessa bactéria. Geramos uma segunda publicação, mapeando genes ribossomais com o grupo da Doutora Bárbara Vold. O mapeamento dos genes ribossomais é bastante difícil, pois eles estão organizados em operon sempre perto da origem de replicação; até hoje é uma dor de cabeça nos projetos genomas organizar essa região, pois o fato de tais genes serem altamente conservados, ou seja, suas seqüências nucleotídicas são praticamente iguais, dificulta o estabelecimento da ordem correta na sua localização no genoma bacteriano. No laboratório, antes do projeto genoma, seqüenciávamos manualmente. Já que teríamos que seqüenciar o que era então considerado grande região genômica, precisávamos de um aparelho automático. O nosso aparelho de seqüenciamento automático foi o primeiro a chegar ao centro de pesquisa do INRA de Jouy-en-Josas. Pelas regras do projeto, tínhamos que seqüenciar 25 kb ano. Já tínhamos identificado dois YACs que cobriam a região que iríamos seqüenciar, mas resolvemos primeiro implantar, rotineiramente, o seqüenciamento automático no laboratório, seqüenciando três bacteriófagos lambda que possuíam insertos que cobriam a região spoVAF-serA. O seqüenciamento dos 30 kb da região spoVAFserA foi utilizado como o treino de que necessitávamos para o seqüenciamento em escala maior. O seqüenciamento constitui uma das fases; o objetivo final dos projetos genoma é descobrir a função dos genes e suas interações na rede de regulação celular. Desde o começo da minha tese, queria fazer análise funcional. Tradicionalmente, essas análises começavam com a clonagem do gene, seqüenciamento, a disrupção gênica e a tentativa de correlacionar o seu genótipo com o fenótipo. Tínhamos seqüenciada uma região de 30 kb e, conversando com Dr. Ehrlich sobre esse enfoque funcional que queria conferir à minha tese, surgiu a idéia de fazer uma análise funcional em larga escala. Pensamos, então, em construir um mapa de transcrição da região que seqüenciamos. Bacillus subtilis é uma bactéria que se diferencia e que cresce em meios de cultura bem simples. Construímos esse mapa, usando diferentes meios e fases do seu ciclo celular. Esse tipo de mapa, em uma região de tal extensão, também foi o primeiro. O 26
seqüenciamento e o mapa de transcrição entre os genes spoVAF foram publicados juntos em uma edição da revista Molecular Microbiology, dedicada aos resultados obtidos no projeto genoma da B. subtilis. Começamos, em seguida, a seqüenciar um YAC de 100 Kb que cobria metade da nossa região. Esse trabalho exigiu várias mudanças na estratégia inicial e a utilização de novos métodos lançados naquela época. Subclonamos o YAC (clone 15-6B) em bacteriófago M13, seqüenciamos os subclones escolhidos ao acaso e depois fechamos as seqüências com a técnica de PCR. Saliento que a nossa equipe do projeto era composta de quatro pesquisadores e uma técnica, o que é uma equipe pequena para projetos dessa dimensão. O trabalho que desenvolvi durante a minha tese de doutorado com a referida equipe gerou-me oito artigos e dois capítulos de livros. Um desses artigos foi publicado na prestigiosa revista Nature e um dos capítulos de livro foi publicado no livro referência para quem estuda Bacillus subtilis, “Bacillus subtilis and other Gram-positive bacteria: biochemistry, physiology and molecular genetics”, publicado pela American Society for Microbiology (ASM). Em 29 de junho de 1993, defendia a minha tese de doutorado. Primeira tese defendida sobre esta temática na Europa. A banca examinadora foi constituída por Claude Gaillardin (Presidente da banca e professor do INAP-G), Franz Kunst (Chefe do programa europeu de seqüenciamento do genoma de B. subtilis e pesquisador titular do Instituto Pasteur), Antoine Danchin (pesquisador principal do Instituto Pasteur e responsável pelo processamento dos dados do projeto e suas análises) Stewart Cole (Chefe do programa de seqüenciamento do genoma de Mycobacterium tuberculosis e pesquisador titular do Instituto Pasteur), Bernard Dujon (Coordenador na França do programa de seqüenciamento do genoma de Saccharomyces cerevisiae e pesquisador titular do Instituto Pasteur) e meu orientador, Dr. Dusko Erlich. A minha tese foi considerada pela banca superior à média européia e fiquei muito satisfeito por conseguir obter a nota mais alta dada na França e por receber as felicitações do júri. Foi uma época excepcional na minha vida científica. O laboratório trabalhava com, praticamente, todos os temas relacionados com genética de microrganismos e participávamos de dois seminários por semana, quando os trabalhos dos grupos 27
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