Revista Newslab edição 180

CITOMETRIA DE FLUXO
CONTROLES EM CITOMETRIA DE FLUXO
Por Helena Varela de Araújo, Rafaele Loureiro Azevedo, Fernanda Vitelli Lins e Bruna Garcia Nogueira
Em experimentos utilizando
citometria de fluxo, os controles
desempenham papel
fundamental na obtenção de
resultados confiáveis. Eles são
responsáveis por distinguir
informações reais de inespecificidade
e background.
Explicaremos aqui os tipos de
controles que podem ser utilizados
em seus experimentos, para
que você obtenha resultados
ainda melhores.
Controle não marcado
Controles não marcados são
importantes para ajudar a
definir suas populações celulares
e otimizar o citômetro de
fluxo para a sua análise, sendo
fundamentais para ajustar as
voltagens dos PMTs. Além disso,
têm papel fundamental na verificação
da autofluorescência das
células do seu experimento.
amostras marcadas com todos
os fluoróforos do painel que
você usará na marcação da sua
amostra teste, assim como as
células da sua amostra teste,
menos um deles. Esse tipo de
controle é utilizado para definir
o limite superior do sinal emitido,
identificando e bloqueando
populações positivas em experimentos
com múltiplas cores
de fluorescências. Os FMOs são
necessários e têm um importante
papel quando os positivos
não estão claramente separados
dos negativos, graças ao nível
baixo de expressão do antígeno
marcado. Uma vez validado o
painel, alguns dos FMOs podem
ser eliminados e apenas aqueles
para populações mais difíceis
de serem detectadas são subsequentemente
analisados.
Controles de viabilidade celular
Restos celulares possuem um
alto nível de autofluorescência
e marcações inespecíficas com
anticorpos, podendo gerar
resultados falso positivos.
Dessa forma, a qualidade da
amostra vai determinar a qualidade
dos dados obtidos. Em
um gráfico utilizando SSC x
FSC podemos excluir debris e
algumas células mortas, porém
não todas. Devido a isso um
controle de viabilidade celular
deve ser incluído no painel.
O primeiro tipo de controle de
viabilidade é o que se liga ao
DNA (como Iodeto de Propidio,
DAPI e 7-AAD). Eles se ligam ao
ácido nucleico, mas não conseguem
atravessar a membrana
celular intacta. O outro tipo
Figura 1. Populações negativas para PE em gráfico tipo dot-plot demonstrando maior
dispersão em painel multicolor, requerendo assim um controle FMO para identificação
precisa de populações positivas.
Fluorescência menos um (FMO)
Fluorescência menos um (do
inglês Fluorescence Minus One)
é o termo usado para falar sobre
um tipo de Controle utilizado
em Citometria de Fluxo. São
Referência da imagem:
https://www.uth.edu/imm/service-centers/flow-cytometry/gfx/FMO.png?language_id=1
166 Revista NewsLab Edição 180 | Novembro 2023