Medical and Biological Sciences XXII/1 - Collegium Medicum ...

66Marta Pokrywczyńska i in.WSTĘPPrzeszczep wysp trzustkowych jest metodą leczeniacukrzycy typu I, pozwalającą na utrzymanie stałejnormoglikemii. Na wyniki przeszczepiania wysptrzustkowych wpływa wiele czynników, spośród którychnajistotniejsze to jakość wyizolowanych wysptrzustkowych, a więc czystość, żywotność, wydajnośćw produkcji insuliny oraz liczba wyizolowanych wysp[1, 2]. Wszystkie te czynniki zależą od metody izolacji.Celem pracy było opracowanie metody izolacjiwysp trzustkowych szczura.MATERIAŁ I METODYMateriał do badań stanowiło 6 trzustek szczura rasyLewis o masie 361,29 - 562,40 g. Badania przeprowadzonoza zgodą Lokalnej Komisji Etycznej do sprawdoświadczeń na zwierzętach. Celem wycięcia trzustkizwierzęta znieczulano poprzez dootrzewnową injekcjępentobarbitalu sodu w dawce 0,4mg/g (Biowet, Polska).Przed wycięciem trzustkę nastrzykiwano poprzezprzewód żółciowo-trzustkowy roztworem enzymutrawiennego, kolagenazą P w stężeniu 1mg/ml (Sigma,Niemcy). Przewód żółciowo-trzustkowy uchodzący dodwunastnicy zaciskano kleszczykami, aby zapobiecprzepływowi enzymu trawiennego, którym nastrzykiwanabyła trzustka, do jelita cienkiego. Przewód żółciowo-trzustkowykaniulowano welflonem 26G (BDNeoflon, Anglia) połączonym ze strzykawką zawierającąenzym. Przecinano żyłę główną dolną w celuzmniejszenia napływu krwi żylnej w obrębie trzustki.Trzustkę nastrzykiwano 10 ml schłodzonego do temperatury4°C roztworu kolagenazy P, a następnie wycinano.Izolacje wysp trzustkowych przeprowadzono wgzmodyfikowanej metody: P.E. Lacy i M. Kostianowsky[3]. Trzustkę umieszczano na płytce Petriego nalodzie, a następnie płukano w zbalansowanym roztworzesoli Hanka (HBSS, Hank’s Balanced Salt Solution,Sigma) z dodatkiem antybiotyków: penicyliny 10.000U/ml (PAA) i streptomycyny 10.000 µg/ml (PAA,Austria). Czynność powtarzano trzykrotnie. Usuwanowidoczne naczynia krwionośne oraz tkankę tłuszczową.Trzustkę cięto na mniejsze fragmenty i przenoszonodo 15 ml falkonu zawierającego 5 ml schłodzonegoroztworu kolagenazy P o stężeniu 1mg/ml. Falkonz trzustką umieszczano na 15-20 minut w łaźni wodnejpodgrzanej do temperatury 37°C. Po 10 min trawieniafalkony wyjmowano z łaźni wodnej i potrząsanoenergicznie przez kilkanaście sekund w celu zwiększeniaefektywności rozdrabniania tkanki trzustkowej,a następnie z powrotem wkładano do łaźni wodnej.W zależności od stopnia rozbicia tkanki trzustkę trawionoprzez kolejne kilka minut, sprawdzając makroskopowostan strawienia. W celu zatrzymania aktywnościenzymu strawioną tkankę trzustkową przenoszonodo falkonów ze schłodzonym medium rozcieńczającym.Medium rozcieńczające (HBSS 10%) składało sięz HBSS, (Sigma), 1M HEPES (Sigma), 100 µg/mlDNA-zy (Sigma) komplemetowanej 10% płodowąsurowicą wołową (FBS, Fetal Bovine Serum, PAA)z dodatkiem antybiotyków: penicyliny 10.000 U/ml(PAA) i streptomycyny 10.000 µg/ml (PAA). Falkonywirowano przez 10 minut w temperaturze 4°C przy240 x g. Supernatant zlewano, a osad komórkowypowstały po odwirowaniu zawiesiny rozpuszczanow 10 ml 10% HBSS. Zawiesinę komórek filtrowanoprzez stalowe sitko o średnicy porów 380 µm. Przefiltrowanązawiesinę komórek rozlewano do 15 ml falkonów,a następnie wirowano przez 10 minut w temperaturze4°C przy 240 x g. Pobierano próbki zawiesinykomórek, w których oceniano zawartość wolnych wysptrzustkowych. Na podstawie liczby i wielkości wysptrzustkowych obliczano Wskaźnik RównoważnościWysp Trzustkowych (IEQ, Islet EQuivalent), tzw. IEQpre-Gradisol. W wyniku trawienia enzymatycznegotkanki trzustkowej otrzymano heterogenną zawiesinękomórek. W celu oczyszczenia wysp trzustkowych odpozostałych typów komórek, zawiesinę uzyskanych wwyniku trawienia komórek wirowano w nieciągłymgradiencie gęstości Gradisolu. W tym celu osad komórkowyrozpuszczano w Gradisolu o gęstości 1,110g/ml w stosunku max. 300 µg komórek/ 3 ml Gradisolu.Na warstwę 3 ml zawiesiny komórek w Gradisolu1,110 g/ml nakrapiano po 3 ml Gradisolu o gęstości1,069 i 1,037 g/ml. Próbówki wirowano przez 20 minutprzy 800 x g. Po zwirowaniu komórek w gradienciegęstości Gradisolu komórki z poszczególnych warstwgradientów zbierano do osobnych probówek, a następnierozpuszczano w medium płuczącym i wirowanoprzez 10 minut przy 240 x g. Medium płuczące (10%RPMI 1640) składało się z RPMI 1640 (Roswell ParkMemorial Institute, Sigma) komplemetowanego 10%FBS (PAA) z dodatkiem antybiotyków: penicyliny10.000 U/ml (PAA) i streptomycyny 10.000 µg/ml.Zlewano supernatant, a osad komórkowy rozpuszczanow 10% RPMI 1640. Z warstwy I, II, III oraz peletki