Medical and Biological Sciences XXII/1 - Collegium Medicum ...

Opracowanie metody izolacji wysp trzustkowych szczura 67pobierano 100 µl próbki zawiesiny komórek, w którychsprawdzano obecność wysp trzustkowych.Z próbek pobranych z warstw I oraz II obliczano IEQtzw IEQ post-Gradisol.Wskaźnik Równoważności Wysp Trzustkowychobliczano przed oraz po oczyszczaniu wysp w gradienciegęstości Gradisolu. W celu odróżnienia wysptrzustkowych od tkanki egzokrynnej zawiesinę komórekwybarwiano Ditizonem (Diphenylthiocarbazone,DTZ). Roztwór DTZ przygotowywano poprzez rozpuszczenie50 mg DTZ (Fluka, Niemcy) w 5ml dimetylosulfotlenku(Dimethylosulfoxide, DMSO, Sigma)i dopełnienie do objętości 50 ml roztworem HBSS(Sigma). Roztwór DTZ filtrowano przez filtr o średnicyporów 0,22 µm. Z każdej warstwy (1,2,3 oraz peletki)pobierano co najmniej dwie próbki zawiesiny komórek.Każda o objętości 100 µl. Próbki inkubowanoz roztworem DTZ. Wyspy trzustkowe liczono podmikroskopem świetlnym odwróconym (Nicon EclipseTS100, Precoptic, Polska) pod powiększeniem 100 x.Przy pomocy mikrometru siatkowego umieszczonegow okularze mikroskopu oceniano wielkość wysptrzustkowych. Wielkość wysp trzustkowych kwalifikowanow przedziałach wielkości 50-100, 101-150,151-200, 201-250, 251-300, 351-400 i >400 µm. Nieliczono wysepek trzustkowych o wielkości mniejszejniż 50 µm. Nie liczono wysp trzustkowych o nieprawidłowejmorfologii oraz wysp słabo barwiących sięroztworem DTZ. IEQ obliczano poprzez pomnożenieliczby wysp trzustkowych z poszczególnych zakresówpoprzez odpowiadający im współczynnik konwersji[4]. IEQ obliczano osobno dla warstwy I oraz II. Wynikizolacji stanowił sumę uśrednionych wartości IEQz warstw I i II.Czystość wysp trzustkowych oceniano szacunkowopoprzez określenie stosunku procentowego liczbywysp trzustkowych na tle komórek tkanki egzokrynnej.Barwienie roztworem DTZ pozwoliło na odróżnieniewysp trzustkowych od komórek tkanki egzokrynnej.Żywotność wysp trzustkowych określono przy pomocybarwienia jodkiem propidyny (Propidium Iodide,PI, Sigma) i dioctanem fluoresceiny (Fluorescein Diacetate,FDA, Sigma) [5]. Ocenę żywotności wysptrzustkowych wykonano pod mikroskopem fluorescencyjnym(Nicon Eclipse TS 100). Wykonano dokumentacjęfotograficzną. Wyniki poddano analizie porównawczej.WYNIKIMasy trzustek po usunięciu tkanki tłuszczoweji naczyń krwionośnych wynosiły 2358,2 mg (izolacjanr 1), 2750,7 mg (izolacja nr 2), 2639,6 mg (izolacja nr3), 2303,9 (izolacja nr 4), 1955,4 mg (izolacja nr 5)i 2035,6 mg (izolacja nr 6). Czas trawienia enzymatycznegowynosił 14-17 minut. W chwili zatrzymanatrawienia enzymatycznego nie obserwowano agregatówkomórek niestrawionej tkanki trzustkowej. Poprzefiltrowaniu zawiesiny komórek tylko niewielkailość tkanki osadziła się na sitku, co jest objawemprawidłowo wykonanego wycięcia trzustki i trawieniaenzymatycznego.W wyniku wirowania w gradiencie gęstości Gradisoluwyspy trzustkowe zlokalizowały się w główniew dwóch warstwach, pierwszej szczytowej warstwie(WI) tzw. top-layer, tj. Gradisolu o gęstości 1,037g/mloraz drugiej warstwie (WII), tzw. bottom-layer nagranicy gradientów 1,037 i 1,069 g/ml. Tkanka egzokrynna,która jest najcięższą tkanką, osadziła sięw peletce. W szczytowej I warstwie zlokalizowały sięmniejsze wyspy trzustkowe. Czystość I warstwy wynosiła80-95%. W II warstwie zlokalizowały się niecowiększe wyspy. Czystość II warstwy wynosiła ok. 45-50%. W III warstwie odnaleziono nieliczne wyspytrzustkowe. W peletce znalazły się wyspy trzustkoweotoczone niestrawioną tkanką egzokrynną. Żywotnośćwysp trzustkowych wynosiła 50-95%. Wyniki izolacjiwysp trzustkowych przedstawiono w tabeli I.Tabela I. Wyniki izolacji wysp trzustkowych szczuraTable I. Rat islet isolation yieldNrizolacjiNumberofisolationCzastrawieniaDigestiontimeIEQpre-GradisolIEQpre-GradisolIEQpost-GradisolIEQpost-GradisolCzystośćWI i WII(%)Purity ofLI andLII (%)Żywotnośćwysp (%)Islet viability(%)I 15 1775,97 1205,67 95 i 45 80- 95II 15 1834,09 1259,78 80 i 45 80-90III 14 1604,39 1008,43 85 i 40 80- 95IV 17 2954,53 2055,68 90 i 50 50-90V 16 1975,06 1530,00 90 i 50 70-90VI 15 2105,46 1300,53 95 i 50 85-95WI- warstwa pierwsza; LI- first layerWII- warstwa druga; LII- second layer