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CHEMIE & TECHNIK
© Agilent Technologies
© Agilent Technologies
In Term B steckt die sogenannte Longitudinal-Diffusion,
die von der Viskosität und
Temperatur des Eluenten abhängt. Ausgehend
von einem konzentrierten Probenzonen-
Zentrum diffundieren die einzelnen Analyten
im Laufe der Chromatographie kontinuierlich
in beide Richtungen der Säulenlängsachse auseinander.
Je kürzer die Verweilzeit in der
Trennsäule ist, desto geringer ist der Beitrag
der Longitudinal-Diffusion, und deshalb sinkt
der B-Term schnell mit steigender Fließgeschwindigkeit
(grün in Bild 1).
Massentransfer beschleunigen
Der besonders wichtige C-Term beschreibt
den Widerstand beim Massentransfer zwischen
der stationären und der mobilen Phase.
Da der Stoffaustausch grundsätzlich etwas
Zeit benötigt, wird er durch geringe Flussraten
begünstigt, daher verhält sich der C-
Bild 2: Partikelgrößenverteilung (als
Abweichung von der jeweiligen mittleren Partikelgröße
dargestellt) von verschiedenen voll
porösen Materialien (blau, grün, schwarz)
und einem Superficially Porous Particle-
Material (2.7 μm in Rot) im Vergleich.
Term auch proportional zur Fließgeschwindigkeit.
Während schnelle Chromatographie
(u=hoch) die unerwünschte Longitudinal-
Diffusion stark zurückdrängt, ist ihr Einfluss
auf einen intensiven Stoffaustausch wiederum
kontraproduktiv. Der Massentransfer ist
unter anderem auch von der Art der mobilen
Phase, Länge und Durchmesser der Säule
und Porosität der Teilchen abhängig. Bleiben
diese Parameter gleich, wird in Bild 1 oben
rechts deutlich, dass die Massenübertragung
vom Teilchendurchmesser bestimmt wird.
Genau diese Möglichkeit, den Massentransfer
mit kleinen Teilchen zu verbessern und
damit den C-Term zu reduzieren, ist der
Grund für den zunehmenden Marktanteil an
sub-2-Micron-Säulen.
Die neuen Säulen mit Partikelgrößen von 1,7
bis 1,8 µm sind deutlich effizienter als die
herkömmlichen mit 5 bzw. 3 µm, stellen
aber auch wesentlich höhere Ansprüche an
die LC-Hardware. Es bauen sich wesentlich
höhere Rückdrücke auf, und deutlich engere
und kürzere Verbindungskapillaren sind notwendig,
um deren Todvolumen klein zu halten.
Im selben Maße steigen die Anforderungen
an die Partikelfreiheit der Lösungen und
Proben. Der Trend in Richtung unter 2 μm
wird aber trotz aller Erschwernisse anhalten.
Bild 3: Größenvergleich (schematische Darstellung) von sub-2-Micron und Superficially
Porous Partikel („Poroshell“)
Den Verbesserungseffekt im C-Term durch
gesteigerten Massentransfer kann man auch
nutzen, wenn die absolute Partikelgröße zwar
2,7 µm beträgt, aber die trennrelevante Zone
nur 0,5 µm dick ist. Damit sind wir bei den
neuen Superficially Porous Particles (oberflächenbeschichtete
Partikel; SPP). Diese besitzen
als Träger einen undurchlässigen, stabilen
Kern, und nur die Randschicht ist als
poröse Struktur für die Analyten zugänglich
(Bild 4). Dadurch reduziert sich die Wege-
Variabilität und die Effizienz steigt um ca. 25
Prozent gegenüber völlig porösem Standardmaterial
(Totally Porous Particle TPP).
Aber auch bei den neuen SPP-Materialien
wird das hohe Drucklimit moderner UH-
PLC-Hardware ausgenutzt, denn einige Säulenhersteller
haben bereits die Partikelgröße
ihrer neuesten SPP-Generation auf 1,6 µm
reduziert (Bild 5).
Oft wird befürchtet, dass die neuen „Superficially
Porous“-Partikel weniger Probenkapazität
als gleich große konventionelle „Totally
Porous“-Partikel aufweisen. Theoretisch
ergibt sich bei den SPP mit 2,7 µm Teilchendurchmesser
und 0,5µm Shell-Dicke tatsächlich
ein um ca. ein Viertel geringerer Anteil
an porösem Trennmaterial, das aktiv an der
Trennung beteiligt ist. Großteils hat sich bei
Vergleichsmessungen mit verschiedenen Produkten
diverser Hersteller aber gezeigt, dass
die Probenkapazitäten von SPPs unter gleichen
Bedingungen jenen von TPPs in der
Praxis durchaus ähnlich sind (2).
Druck verändert die Trennungen
Durch die Verfügbarkeit von vielen sub-
2-Micron-Säulen und der immer weiter verbreiteten
Ausrüstung mit UHPLC-Hardware
ist der Einfluss von sehr hohen Drücken bzw.
Druckunterschieden in den Fokus des Interesses
gerückt. Zahlreiche Untersuchungen
haben sich mit den Auswirkungen auf verschiedene
Parameter beschäftigt. Bei einer
Präsentation auf der „HPLC 2013
Amsterdam“-Konferenz hat Ronald E.
Majors von Agilent Technologies die komplexen
Ergebnisse zusammengefasst (3).
Stark vereinfacht ergeben sich daraus folgende
Erkenntnisse für eine Steigerung des
Pumpendrucks um jeweils 500 bar:
n Neutrale Analyten mit niedrigem Molekülgewicht
können ihr Retentionsverhalten
um bis zu zwölf Prozent ändern. Bei
den meisten hat sich der k-Wert in Systemen
mit Wasser-Acetonitril bzw. Wasser-
Methanol aber nur um 2 bis 6 Prozent
geändert.
n Hochmolekulare Substanzen aus dem
Neutralbereich jedoch steigern ihre Reten-
54 | chemiereport.at AustrianLifeSciences 1/2016