charakterisierung von organellen und signalwegen des thrombozyten
charakterisierung von organellen und signalwegen des thrombozyten
charakterisierung von organellen und signalwegen des thrombozyten
Sie wollen auch ein ePaper? Erhöhen Sie die Reichweite Ihrer Titel.
YUMPU macht aus Druck-PDFs automatisch weboptimierte ePaper, die Google liebt.
3.7.3 Silberfärbung <strong>von</strong> SDS-Polyarylamid-Gelen<br />
Die Silberfärbung wurde wie folgt durchgeführt:<br />
1. Fixierlösung<br />
2. Konditioner<br />
3. Destilliertes Wasser<br />
4. Färbelösung<br />
5. Destilliertes Wasser<br />
6. Entwicklerlösung<br />
7. Stoplösung<br />
3.7.4 „Western-Blot“<br />
3. Material <strong>und</strong> Methoden<br />
Lösungen (3.4) Inkubationszeit<br />
60 min<br />
30 min<br />
3 × 10 min<br />
30 min<br />
30 sec<br />
je nach Intensität<br />
10 min<br />
Nach SDS-PAGE (3.7.1) erfolgte der Transfer der Proteine auf Nitrozellulose<br />
(Porengröße: 0,45 �m) unter Verwendung einer Mini-Transblot-Zelle (Biorad<br />
Laboratories GmbH, München) nach Herstellerangaben <strong>und</strong> Kionka (1986). Das<br />
„Blotten“ erfolgte für 1 h bei 300 mA in Proteintransferpuffer (3.4). Die Nitrozellulose<br />
wurden 1 min in PonceauS-Färbelösung (3.4) inkubiert <strong>und</strong> anschließend wurden die<br />
angefärbten Markerbanden markiert.<br />
Die Imm<strong>und</strong>etektion erfolgte nach folgendem Schema:<br />
Blocken<br />
Waschen<br />
1. Antikörper<br />
Waschen<br />
2. Antikörper<br />
Waschen<br />
Lösung Inkubation<br />
5 % (w/v) Milchpulver o. BSA in TBST o. PBST<br />
TBST o. PBST<br />
AK-spezifische Verdünnung (2.5)<br />
TBST o. PBST<br />
1:10.000 anti-Kaninchen, anti-Maus o. anti-Ziege<br />
TBST o. PBST<br />
1 h bei RT<br />
3 × 10 min<br />
ü.N. bei 4°C<br />
3 × 10 min<br />
1 h bei RT<br />
3 × 10 min<br />
Bei den Sek<strong>und</strong>ärantikörpern handelt es sich um IgG-Antikörper, die mit Meerrettich-<br />
Peroxidase (3.5) gekoppelt sind.<br />
Die Detektion erfolgte gemäß dem ECL Plus Western Blotting Detection System<br />
(3.1).<br />
3.7.5 Proteinmengenbestimmung<br />
Zur Bestimmung <strong>des</strong> Proteingehaltes einer Lösung wurde das „Micro BCA TM Protein<br />
Assay Kit“ <strong>von</strong> Pierce verwendet. Die Durchführung der Messung wurde nach<br />
Herstellervorgaben vorgenommen.<br />
39
Change language