charakterisierung von organellen und signalwegen des thrombozyten

3. Material und Methoden
mittels SDS-PAGE verwenden zu können wurden nach der letzten Zentrifugation 50
µl 2× SDS-Probenpuffer auf die Matrix gegeben, alles vorsichtig gemischt, die Säule
unten verschlossen und bei 95°C im Heizblock erhitzt. Nach 5 min wurde die Säule
unten wieder geöffnet, in ein neues Mikrozentrifugengefäß gestellt und bei 12.000 ×
g für 30 sec bei 4°C zentrifugiert. Das eluierte Immunopräzipitat ist danach zur
weiteren Analyse präpariert.
3.8.9 Immunopräzipitation mittels Dynabeads ®
Für die gesamte Immunopräzipitation wurde Immunopräzipitations-Puffer (3.4)
verwendet. Zunächst wurden die Dynabeads ® mit dem entsprechenden Antikörper
beschichtet. Dazu wurden je Ansatz 50 µl der Dynabeads ® benötigt, diese wurden 3×
mit je 1 ml Immunopräzipitations-Puffer gewaschen. Anschließend wurden auf jeden
Ansatz 800 µl Immunopräzipitations-Puffer gegeben und 2 µg des entsprechenden
Antikörpers (3.5) gegeben bei 4°C auf dem Über-Kopf-Schüttler über Nacht inkubiert.
Am folgenden Tag wurde zunächst die Anzahl der highly purified platelets (3.8.1)
bestimmt. Anschließend wurde ein Ansatz entweder mit 0,01 U/ml Thrombin oder 10
µM ADP für 5 min bei 37°C stimuliert und der andere Ansatz durch 0,02 U/ml
Apyrase in unstimuliertem Zustand gehalten. Proteaseinhibitoren wurden in
folgenden Konzentrationen zu den Proben gegeben: 5 µg/ml Antipain, 2 µg/ml
Aprotinin, 6 µg/ml Chymostatin, 2,5 µg/ml Leupeptin, 1 µg/ml Pepstatin und 2 µg/ml
Natrium Fluorid als Phosphataseinhibitor. Beide Ansätze wurden 5 Mal 30 sec
(dazwischen immer wieder 30 sec auf Eis) mittels Ultraschall lysiert. Die Lysate
wurden 1 h bei 100.000 × g, 4°C zentrifugiert.
Nachdem die Dynabeads ® mit dem Antikörper über Nacht inkubiert hatten, wurden
die Reaktionsgefäße in einen Dynal-MPC ® gestellt, in welchem die Dynabeads sich
an der Wand des Reaktionsgefäßes sammelten, die dem Magneten zugewandt war,
und somit der Überstand mit einer Pipette leicht entfernen und verworfen werden
konnte. Nach einmaligem Waschen der beads mit Immunopräzipitations-Puffer (3.4)
wurden 1 × 10 9 Thrombozyten auf die beads gegeben, das Endvolumen auf 800 µl
aufgefüllt und alles erneut für 2h im Kühlraum auf dem Über-Kopf-Schüttler inkubiert.
Nach der Inkubation wurden die Proben erneut in den Dynal-MPC ® gestellt, der
Überstand wurde abgenommen und die Dynabeads ® 5 Mal mit je 1 ml
Immunopräzipitations-Puffer gewaschen. Nach dem letzten Waschschritt wurden die
Dynabeads ® in 50 µl 2× SDS-Proben-Puffer aufgenommen und waren zur Analyse in
der SDS-PAGE verwendbar.
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