charakterisierung von organellen und signalwegen des thrombozyten

5. Diskussion
80 mL Vollblut einen Gehalt an 2,4 × 10 9 hochreinen Plättchen und eine
Proteinmenge von 3,5 mg. Aus der Aufreinigung von 20 mL Thrombozyten-
Konzentrat erhält man 1,7 × 10 9 hochreine Plättchen und 2,8 mg Protein.
Darüber hinaus bergen die oben genannten Thrombozyten-Präparations-Methoden
weitere Nachteile, wie hohe Kosten und partielle Aktivierung der Thrombozyten
während der Filtrationsprozesse. Aus diesen Gründen kam bei der neuen Technik
ein Optiprep ® Gradient zur Anwendung, welcher nachweislich schonend für die
Blutplättchen ist und die Zellen daher während der Prozedur einen hervorragenden
morphologischen Status beibehalten (Ford et al. 1990) (Bagamery et al. 2005). Nach
Vergleich mehrerer alternativer Zentrifugations- und Waschschritte wurde die
beschriebene Aufreinigungstechnik (3.8.1) als am effektivsten bewertet, da die oben
erwähnten Probleme, wie Kontamination durch andere Zellen oder Aktivierung
während der Aufreinigung, behoben werden konnten. Der Beweis für die Effektivität
dieser Methode wurde erbracht, indem die Effizienz von Leukozyten-, Erythrozyten-
und Serumprotein-Depletion (Abb. 4-5, 4-6) und die Funktionalität zweier wichtiger
Thrombozyten-Rezeptoren, dem Prostacyclin- (PGI2) und dem ADP- (P2Y12)
Rezeptor, überprüft wurden (Abb. 4-9).
Gerade die Kontamination durch Leukozyten ist ein schwerwiegendes Problem bei
der Thrombozyten-mRNA-Analyse, da der mRNA-Gehalt in Leukozyten etwa
12.500fach höher ist als der in Blutplättchen (Fink et al. 2003). Anhand von
durchflusszytometrischen Untersuchungen konnte eine vollständig Eliminierung von
Leukozyten in beiden Präparationen (Abb. 4-6) nachgewiesen werden. Die effektive
Eliminierung von Leukozyten wurde zudem noch mittels RT-PCR unter Verwendung
von gen-spezifischen Primern für Leukozyten (CD15 und HLA-DQ�) (Abb. 4-7)
verifiziert. Da die Detektionsgrenze bei der FACS-Analyse zwischen 1-350
Leukozyten/µl liegt, erfolgte diese zusätzliche Reinheitsüberprüfung auf der Basis der
RNA, da die RT-PCR eine wesentlich sensitivere Methode ist und bereits ein Molekül
Leukozyten-mRNA nachweist. Es war keiner der beiden Marker (CD15 und HLA-
DQ�) in der Thrombozyten-cDNA nachweisbar, die aus den aufgereinigten
Blutplättchen des neu entwickelten Protokolls isoliert worden waren.
Während diese Reinheitskontrollen eine generelle Standardüberprüfung bei mRNA-
Analysetechniken wie Microarray und SAGE Analysen sind, fehlen sie meist bei
Untersuchungen mittels Proteom-Techniken. Diese Tatsache muss sehr kritisch
betrachtet werden, da der Proteingehalt von Leukozyten 65x höher ist, als der von
80