charakterisierung von organellen und signalwegen des thrombozyten
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3.7.14 Sequenzierung <strong>von</strong> PCR-Produkten<br />
3. Material <strong>und</strong> Methoden<br />
Um die erwarteten PCR-Fragmente zu verifizieren, wurde nach der Gel-<br />
Elektrophorese eine Sequenzierung durchgeführt. Hierfür wurden 10 µl <strong>des</strong> PCR-<br />
Reaktionsansatzes <strong>und</strong> 10 µl je<strong>des</strong> Gen-spezifischen Primers in einer Konzentration<br />
<strong>von</strong> 10 pmol/µl an den Sequenzierungs-Service der Firma Qiagen in Hilden geliefert.<br />
Die Bewertung der Sequenzierungs-Ergebnisse wurde mit Hilfe <strong>des</strong> Programms<br />
Blast 2.0 (Basic Local Alignment Search Tool) vorgenommen.<br />
3.8 Zellbiologische Methoden<br />
3.8.1 Präparation <strong>von</strong> hochreinen Thrombozyten („highly purified platelets“)<br />
Zur Generierung <strong>von</strong> hochreinen Thrombozyten wurden sowohl Vollblut als auch<br />
Thrombozytenkonzentrate <strong>von</strong> ges<strong>und</strong>en Spendern verwendet, die innerhalb der<br />
letzten 2 Wochen keine Medikamente eingenommen hatten.<br />
Es wurden 40 ml Vollblut in 10 ml CCD-Puffer (3.4) aufgenommen <strong>und</strong> für 20 min bei<br />
300 × g bei Raumtemperatur ohne Bremse zentrifugiert. Nach der Zentrifugation<br />
wurde die oberste Fraktion (PRP = „Plättchen-reiches-Plasma“ (Abb. ...) vorsichtig<br />
mit einer Plastikpipette abgenommen ohne dabei die Leukozytenschicht zu stören.<br />
Das PRP wurde erneut für 10 min bei 500 × g bei Raumtemperatur ohne Bremse<br />
zentrifugiert. Anschließend wird der Überstand abgenommen <strong>und</strong> das<br />
Thrombozyten-Pellet in HEPES/NaCl Puffer (3.4) aufgenommen.<br />
Die Thrombozytenkonzentrate wurden <strong>von</strong> der Abteilung für Transfusionsmedizin<br />
bereits nach Standardmethoden vorgereinigt. Die washed platelets aus den<br />
Konzentraten (WP) wurden ebenso hergestellt, wie beim Vollblut.<br />
Die beiden Suspensionen (WP) wurden auf je einen diskontinuierlichen Gradienten<br />
mittels einer Pumpe geschichtet. Der Gradient bestand, <strong>von</strong> unten nach oben, aus 15<br />
ml 17%iger Optiprep ® -Lösung mit einem Brechungsindex <strong>von</strong> 1,3495, 14 ml 13%iger<br />
Optiprep ® -Lösung mit einem Brechungsindex <strong>von</strong> 1,346 <strong>und</strong> 14 ml 10%iger<br />
Optiprep ® -Lösung mit einem Brechungsindex <strong>von</strong> 1,343 in HEPES/NaCl-Puffer.<br />
Anschließend wurde der Gradient bei 300 × g für 20 min ohne Bremse bei<br />
Raumtemperatur zentrifugiert. Nach der Zentrifugation wurde eine 7,5-ml-Fraktion<br />
(W1, Abb. ...), die vorwiegend Serumproteine enthielt, <strong>von</strong> oberhalb <strong>des</strong> Gradienten<br />
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