charakterisierung von organellen und signalwegen des thrombozyten

3. Material und Methoden
Um den Löslichkeitsverlust zu vermeiden, durfte das Pellet nicht komplett trocknen.
An diesem Punkt wurde die RNA in 30 µl DEPC versetztem Wasser gelöst und
gelegentlich gemischt, während sie 10 min bei Raumtemperatur inkubierte.
Für jede Probe wurden zur Quantifikation drei Verdünnungen (3 × 1:100) mit DEPC
treated water hergestellt. Die restliche RNA wurde bei -80°C aufbewahrt.
3.7.8 RNA-Quantifizierungs und Reinheitsüberprüfung
Die Konzentration von RNA wurde durch eine Absorptionsmessung bei 260 nm
(A260) in einem Spektrophotometer, mittels einer Quartz Küvette und DEPC treated
water als Referenz, gemessen. Um die Aussagekraft zu gewährleisten wurden nur
A260 Messungen, die größer als 0,15 waren als zuverlässig angesehen. Eine
Absorption von 1 Einheit bei 260 nm entspricht 44 µg ssRNA pro ml. Daher konnte
der Gehalt an RNA von jeder 1:100-Verdünnung wie folgt berechnet werden:
RNA [µg/ml] : 44 µg/ml × Verdünnungsfaktor (1:100) × A260
Die Reinheitskontrolle wurde ebenfalls mit Hilfe von photospektrometrischen
Messungen durchgeführt. Hierfür wurde der Absorptionswert jeder Probe bei 280 nm
zusätzlich zu dem bei 260 nm bestimmt. Das Verhältnis zwischen den beiden
Absorptionswerten (A260/A280) ließ somit eine Bewertung der RNA-Reinheit in
Hinsicht auf die Verunreinigungen, die das UV Licht absorbieren, wie beispielsweise
Proteine, zu. Reine RNA hat einen A260/A280 Verhältnis von 1,7 – 2,0. Nur Proben,
die dieses Kriterium erfüllt haben wurden für eine anschließende cDNA-Synthese
weiterverwendet.
3.7.9 DNA-Quantifizierung
Der Gehalt an DNA wurde auch photospektrometrisch gemessen. Eine Absorption
von 1 Einheit bei 260 nm entspricht 50 µg dsDNA pro ml. Die DNA-Konzentration der
1:100-Verdünnungen konnte, wie folgt, bestimmt werden:
DNA [µg/ml] : 50 µg/ml × Verdünnungsfaktor (1:100) × A260
DNA-Proben mit einem A260/A280 Verhältnis von 1,8 – 2,0 wurden als rein gewertet
und standen für anschließende Versuche zur Verfügung.
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