charakterisierung von organellen und signalwegen des thrombozyten

4 Ergebnisse
4. Ergebnisse
Ein Ziel dieser Arbeit war es, eine Methode zu entwickeln, mit welcher sich
Thrombozyten von anderen Blutbestandteilen separieren lassen, so dass für
anschließende Untersuchungen Kontaminationen wie mRNA oder Proteine aus
anderen Quellen als den Thrombozyten ausgeschlossen werden konnten. Nach
Entwicklung dieser Aufreinigungsprozedur standen diese sogenannten hochreinen
Plättchen für die detailliertere Charakterisierung von Thrombozyten zur Verfügung.
Im Rahmen der Arbeit fanden sie Anwendung durch die Analyse der Thrombozyten-
Plasmamembran und durch die biochemische Untersuchung von postulierten
Proteininteraktionen, zwischen membrangebundenen Proteinen und Zytoskelett-
organisierenden Proteinen, die bei Signalwegen der Thrombozyten-Aggregation eine
wichtige Rolle spielen.
4.1 Herstellung von hochreinen Plättchen
Die größte Herausforderung bei der Arbeit mit Thrombozyten mRNA ist die
Vermeidung von Kontaminationen durch Leukozyten mRNA. Um dieses Problem zu
beheben, haben wir eine effektive Aufreinigungsmethode entwickelt, die auf einem
diskontinuierlichen Gradienten aus Optiprep ® Lösung basiert.
Bei Aufreingungen nach Hillmann et al. oder Ford et al. hat man während der
Prozedur einen geringen Plättchenverlust und die Thrombozyten behalten ihre
Funktionalität während der Aufreinigung, wie durch Aggregations-Studien und
Nukleotid-Sekretions-Untersuchungen bewiesen wurde (Ford et al. 1990) (Hillmann
et al. 2006). Wir fanden heraus, dass für weiterführende Anwendungen wie Proteom-
Analysen, SAGE oder zur Erstellung einer cDNA-Bibliothek, der Reinheitsgrad der
Thrombozyten dieser publizierten Protokolle insuffizient hinsichtlich der
Kontamination mit Erythrozyten (mikroskopisch untersucht, Daten nicht gezeigt) und
Leukozyten sind, was anhand einer cDNA-Untersuchung mittels einer PCR-Analyse
nachgewiesen werden konnte (Abb. 4-1).
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