charakterisierung von organellen und signalwegen des thrombozyten

5. Diskussion
nur eine geringe Ausbeute an Thrombozyten nach Verwendung von
Filtrationsmethoden (Shiba et al. 1997) (van der Meer et al. 2001). Aus diesem
Grund war ein weiterer wichtiger Aspekt dieser Arbeit die Aktivierung von
Thrombozyten nach Anwendung des entwickelten Aufreinigungsprotokolls zu
überprüfen. Zu diesem Zweck, wurde die Funktionalität von zwei verschiedenen
Rezeptoren (IP und P2Y12 Rezeptor) mittels einer erst kürzlich entwickelten Methode
bestätigt (Geiger et al. 2005) (Abb. 4-9). Die Aktivierung der Thrombozyten durch
Thrombin, Kollagen oder mechanische Reize bewirken eine ADP-Freisetzung aus
den dichten Granula. Werden Blutplättchen andauernd aktiviert – also ständig ADP
ausgeschüttet – dann werden sie desensitiviert, genauer gesagt ihre P2Y1- und
P2Y12-Rezeptoren sind nicht länger funktionell (Holme et al. 1977) (Poole et al.
1993) (Enjyoji et al. 1999) (Baurand et al. 2000) (Hardy et al. 2005). Wenn nach der
Aufreinigungsprozedur die Aktivierung dieser beiden Rezeptoren in hochreinen
Plättchen überprüft wurde und die beiden noch aktiv sind, heißt das, dass die
Thrombozyten durch unsere neue Methode nicht aktiviert worden sind.
Da eine Aktivierung Veränderungen in den posttranslationalen Modifikationen
hervorrufen könnte, ist es essentiell, den Grad der Thrombozyten-Aktivierung
während der Blutspende und der anschließenden Zellisolation zu minimieren. Post-
translationale Modifikationen wie Phosphorylierung (Maguire et al. 2003) (Marcus et
al. 2003) (Garcia et al. 2004) (Garcia et al. 2006) (Zahedi et al. 2006) (Zahedi et al.
2007) und Glykosylierung (Lewandrowski et al. 2006) (Lewandrowski et al. 2007)
werden aktuell in Proteom-Studien an humanen Thrombozyten intensiv untersucht.
Um diese Komponenten der Thrombozyten-Signaltransduktion zu identifizieren,
muss der Grad der Protein-Modifikationen von aktivierten Thrombozyten mit dem von
unstimulierten, ruhenden Thrombozyten verglichen werden. In Hinblick darauf muss
die Verwendung von Substanzen zur Stabilisierung von Thrombozyten-Proben
während der Isolation, wie Agenzien zur Erhöhung des cAMP-Spiegels (z.B.
Prostacyclin), kritisch betrachtet werden, da diese neue Proteinformen durch
Phosphorylierung generieren könnten. Für die Untersuchungen während dieser
Arbeit wurde keine dieser Substanzen verwendet und daher ist eine Veränderung in
post-translationalen Modifikationen auszuschließen.
Anwendung fanden die hochreinen Plättchen zum einen in Arbeiten unseres
Institutes über die Bildung/Speicherung von NOS in humanen Plättchen
(Diplomarbeit Stefan Hartmann, 2007) (Gambaryan et al. 2008). Es konnte gezeigt
82