Эффективное животноводство №4 (161) июнь 2020

More documents

Recommendations

Info

144Птицеводствоwww.agroyug.ruDOI: 10.24411/9999-007А-2020-10024УДК: 619:578. 831.3Никитина Н. В., кандидат биологических наук,ведущий научный сотрудник отдела вирусологии vnivip.nikitina@yandex.ruДмитриев К. Ю., младший научный сотрудник отдела вирусологииВсероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт птицеводства –филиал ФГБНУ ФНЦ «Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт птицеводства» РАНvnivip.dmitriev-18@yandex.ruИММУНОФЕРМЕНТНАЯ ТЕСТ-СИСТЕМАДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИТЕЛ В СЫВОРОТКЕКРОВИ К ВИРУСУ ГЕПАТИТА УТЯТ ТИПА-1Аннотация. Представлены экспериментальныеданные по разработке иммуноферментнойтест-системы для количественного определенияантител в сыворотке крови к вирусу гепатита утяттипа 1. Показано, что иммуноферментная тест-системаобладает высокой чувствительностью, специфичностьюи может найти широкое применениев процессе ретроспективной диагностики и определенияуровня поствакцинального иммунитетапри вирусном гепатите утят типа I.Ключевые слова. иммуноферментный анализ,вирус гепатита утят типа I, антиген, сывороткакрови, специфические антитела.Annotation. Experimental data on the developmentof an enzyme-linked immunosorbent assay system forthe quantitative determination of antibodies in the bloodserum to ducklings hepatitis virus type 1 are presented.It is shown that the enzyme-linked immunosorbentassay system has high sensitivity, specificity and canbe widely used in the process of retrospective diagnosisand determination of post-vaccination immunity in viralhepatitis ducklings type I.Key words: enzyme linked immunosorbent assay,ducklings hepatitis virus type I, antigen, blood serum,specific antibodies.Вирусный гепатит утят типа I (ВГУ- I) являетсявысоко контагиозной, протекающейсверхостро у утят и латентно у взрослойптицы, болезнью с преимущественным поражениемпечени и высокой смертностью молодняка (90-95%) [1,2], что приводит к значительным экономическимпотерям в утководстве [2,3].Первостепенным этапом в борьбе с инфекциейв племенных стадах уток является своевременнаяи правильная диагностика болезни [4].В нашей стране среди серологических методовдля определения уровня антител в пробах сывороткикрови уток широко используют реакцию нейтрализации.За рубежом для контроля иммунного ответа многиеисследователи успешно используют твердофазныйметод ИФА [5,6], обладающий специфичностью,высокой чувствительностью, скоростьюпроведения анализа перед другими аналитическимиметодами [7].
ЭФФЕКТИВНОЕЖИВОТНОВОДСТВО№ 4 июнь2020145Серологические исследования сыворотки кровиутят/уток методом ИФА позволяют делать предварительныепрогнозы об инфицированности стада,скорректировать сроки вакцинации, тем самым позволяютболее рационально и надежно организовыватьработу по профилактике и оздоровлению хозяйствот вирусного гепатита утят типа I.Из-за отсутствия аналогичных тестов в нашейстране разработка отечественной иммуноферментнойтест-системы по определению антител к ВГУ-1имеет первостепенное значение.Целью нашей работы явилась разработка иммуноферментнойтест-системы для количественногоопределения антител к вирусу гепатита утят типа 1.Вирус гепатита утят типа I штамма «ВН-3» культивировалина развивающихся 11-12 – суточныхутиных эмбрионах. Вируссодержащую хориоаллантоиснуюжидкость, собранную от павших эмбрионовс характерными изменениями для вируса гепатитаутят, однократно замораживали, оттаивали иосветляли центрифугированием при 3000 об/минв течение 20 минут, затем концентрировали методомдифференциального центрифугирования при60000 g в течение 1,5 часов. Вирус очищали гельфильтрациейна колонке с макропористым стеклом(МПС) марки 1000 ВГХ в 0,01 М фосфатно-солевомбуфере (ФСБ), рН 7,3-7,5.Разработанная на основе высоко очищенноговируса гепатита тест-система основана на использованиипринципа непрямого твердофазного ИФА,в ходе которого происходит выявление в сывороткекрови утят/уток специфических антител за счетих связывания с иммобилизованным в лунках полистироловогопланшета антигена вируса гепатитаутят типа 1. Очищенный вирус гепатита утят сорбировалив лунках планшета «Maxisorp» (Nunc), вконцентрации 6 мкг/мл в течение 18-20 часов при(4-8) оС в 0,01 М фосфатно-солевом буфере, рН7,3-7,5. Эффективным путем подавления неспецифическоговзаимодействия с носителем являетсяиспользование промывочного буфера 0,01 М ФСБрН 7,3-7,5, содержащего 0,5 М NaCl c 0,1% конечнойконцентрацией детергента твина-20. Отрицательнымконтролем служила нормальная сывороткакрови клинически здоровых утятах, не имеющихантител к возбудителям вирусных болезней. Высокоактивнуюспецифическую сыворотку получали путемтрехкратной иммунизации утят нарастающимидозами очищенного вируса гепатита.Контроли и исследуемые образцы сывороткикрови утят/уток, разведенные 1:400 в фосфатно-солевомбуфере, содержащем 0,5 М NaCl c 0,1% конечнойконцентрацией детергента твина-20, инкубировалив течение 30 мин при 37 °С. После 3-кратнойотмывки тем же буфером в лунках инкубироваликонъюгат (антитела к IgG уток, меченные пероксидазойхрена), в течение 30 мин при 37 °С. Специфическийкомплекс «антиген-антитело» выявлялиантивидовыми IgG, ковалентно связанными с ферментом– пероксидазой хрена, который при взаимодействиис субстратом (Н 2О 2) в составе хромогеннойсмеси (ОФД) вызывал ее окрашивание.Интенсивность окрашивания прямо пропорциональнаконцентрации специфических антител в исследуемойпробе. После остановки реакции 10%раствором серной кислоты, производили учет реакциина иммуноферментном анализаторе при длиневолны 492 нм.Инструментальный спектрофотометрический способучета результатов может быть использован какпри постановке ИФА в одном разведении, так и прираститровке сыворотки крови. Он позволяет количественнооценить титры специфических антител висследуемых пробах путем измерения значений оптическойплотности при длине волны 492 нм. Уравнениелинейной регрессии lg T = 1,36089 lg (S/P) +3,53062, связывает S/P-отношение при разведении1:400 с конечным титром.При постановке ИФА методом титрования конечнымразведением исследуемой сыворотки считаетсяпоследнее ее разведение, в котором ОП492 превышаетОП492 отрицательного контроля в 2,0-2,1 раза.Оценку чувствительности и специфичности иммуноферментнойтест-системы проводили в сравнениис реакцией нейтрализацией (РН) [8]. Присравнительной оценке титров антител в ИФА и РНустановлена высокая корреляция (r= -1,0) их значений.С отрицательными и гетерологичными сывороткамикрови результаты в обоих тестах былиотрицательными (Р <0,05), что согласуется с даннымизарубежных исследователей [6,9].Апробация разработанной иммуноферментнойтест-системы свидетельствует о ее воспроизводимости,высокой чувствительности и специфичностии можно полагать, что данная тест-системанайдет широкое применение в процессе ретроспективнойдиагностики и определения уровня поствакцинальногоиммунитета при вирусном гепатитеутят типа I.Статья написана по госзаданию,№ 0599-2019-0024.ЛИТЕРАТУРА1. Трефилов Б.Б., Никитина Н.В., Дмитриев К.Ю., ТрубицынМ.М. Вирусный гепатит утят типа I (эпизоотология,патогенез и диагностика) // Жур. Эффективноеживотноводство. – 2017. – № 3. – С. 12–13.2. Lin S. L. Circulation and in vivo distribution of duck hepatitisA virus types 1 and 3 in infected ducklings / S. L. Lin, R. C.Cong, R. H. Zhang [et al.] // Archives of Virology. – 2016. –V. 161. – P. 405–416.3. Soliman M. The prevalence of duck hepatitis A virustypes 1 and 3 on Korean duck farms. /M. Soliman, M.M.Alfajaro, M.-H. Lee [et al.] // Arch Virol. – 2015. – V. 160.– P. 493–498.4. Woolcock P.R. and H.J. Tsai. Duck hepatitis. In: Diseasesof Poultry/ D.E. Swayne, J.R. Glisson, L.R. Mc Douglad [etal.] eds Tohn Wiley & Sons// 2013. – P. 422–431.5. Бондаренко В. Иммуноферментный метод диагностикивирусного гепатита утят / В. Бондаренко // Вет.мед. Украины. – 1998. – № 6. – С. 38–39.6. Liu M. Development and evaluation of a VP1-ELISA fordetection of antibodies to duck hepatitis type 1 virus 3 /M. Liu, T. Zhang, Y. Zhang [et al.] // Journal of VirologicalMethods. – 2010. – V. 169. – P. 66–69.7. Верховский О.А. Иммуноферментные тест-системыдля оценки иммунологического статуса птиц / О.А.Верховский, Т.А. Тимофеева, С.Л. Кальнов // Био. –2004. – № 5. – С. 31.8. Трефилов Б.Б., Никитина Н.В., Дмитриев К.Ю. Чувствительностьи специфичность ИФА при выявленииантител к вирусу гепатита утят типа I/ Вопросы нормативно-правовогорегулирования в ветеринарии. –СПб, 2018. – № 1. – С. 30-34.9. Shen Y. Development of an indirect ELISA method basedon the VP3 protein of duck hepatitis A virus type 1 (DHAV-1) for dual detection of DHAV-1 and DHAV-3 antibodies / Y.Shen, A. Cheng, M. Wang [et al.] // Journal of VirologicalMethods. – 2015. – V. 225. – P. 30–34.
Page 1 and 2:
ЭФФЕКТИВНОЕЖИВОТН
Page 3 and 4:
7 ПРИЧИНПОЧЕМУ МОЖН
Page 5 and 6:
Page 7 and 8:
Page 9 and 10:
тел. 8-(8342)-25-27-09 gosplem@l
Page 11 and 12:
РЕДАКЦИОННО-ЭКСПЕР
Page 13 and 14:
Page 15 and 16:
Page 17 and 18:
Page 19 and 20:
Page 21 and 22:
Page 23 and 24:
Page 25 and 26:
Page 27 and 28:
Page 29 and 30:
Page 31 and 32:
ЭФФЕКТИВНОЕ № 4 июн
Page 33 and 34:
Page 35 and 36:
Page 37 and 38:
СТРЕССОльга Лютых,
Page 39 and 40:
Page 41 and 42:
Page 43 and 44:
Page 45 and 46:
Page 47 and 48:
Page 49 and 50:
Page 51 and 52:
Page 53 and 54:
Page 55 and 56:
Page 57 and 58:
Page 59 and 60:
Page 61 and 62:
Page 63 and 64:
Page 65 and 66:
Page 68 and 69:
66 Генетика и племен
Page 70 and 71:
Page 72 and 73:
Page 74 and 75:
72Зоогигиенаwww.agroyug.r
Page 76 and 77:
ЭФФЕКТИВНОСТЬ КОРМ
Page 78 and 79:
Page 80 and 81:
Page 82 and 83:
80Зоогигиенаесли ко
Page 84 and 85:
82Зоогигиенаwww.agroyug.r
Page 86 and 87:
84 Корма и кормление
Page 88 and 89:
86Корма и кормлениеw
Page 90 and 91:
Page 92 and 93:
Page 94 and 95:
Page 96 and 97: 94 Корма и кормление
Page 98 and 99: 96Корма и кормлениеw
Page 100 and 101: 98Корма и кормление
Page 102 and 103: Овцеводство50 18 Кор
Page 108 and 109: 106 Генетика и племе
Page 114 and 115: Ольга Лютых, шеф-ре
Page 130 and 131: 128 Ветеринарияwww.agroy
Page 132 and 133: 130Молочное скотово
Page 144 and 145: 142 Птицеводствоwww.agr
Page 150: 148 Генетика и племе
show all

Эффективное животноводство №4 (161) июнь 2020

Create successful ePaper yourself

Delete template?

Save as template?