PhD download - hirc.botanic.hr, Department of Botany, Faculty of ...

Elektroforeza u gelu agarozeElektroforeza u gelu agaroze upotrijebljena je kako bi se odredila kvaliteta izolacijei koncentracija izolirane DNA te kako bi se razdvojili RFLP produkti. Kako bi seomogućilo nanošenje DNA u jažice i praćenje kretanja fragmenata kroz gel, dobivenimproduktima je prije elektroforeze dodan pufer za nanošenje (30% saharoza, 0,25%brom-fenolno modrilo, 0,25% ksilen-cijanol - Sambrook i sur. 1989).Elektroforeza ukupne stanične DNA provedena je u 0,8% gelu agaroze, u 0,5 xTBE puferu (45 mM Tris-borat, 1 mM EDTA, pH 8) kroz 1 sat pri 100 V (Sambrook isur. 1989). Kako bi se odredila koncentracija i kvaliteta izolirane DNA, u istojelektroforezi su kao standardne DNA korištene DNA bakteriofaga λ (BoehringerManheim) u koncentracijama 50, 100 i 250 ng/µl (Snowdon i Langsdorf 1998).Za detekciju fragmenata DNA dobivenih umnožavanjem trnT-trnF kloroplastneregije i DNA fragmenata dobivenih RFLP metodom korištena je elektroforeza u 1,4%gelu agaroze. Ta elektroforeza je također provedena u 0,5 x TBE puferu i pri naponuod 100 V, dok brom-fenolno modrilo nije prošlo 10 cm kroz gel. Kao DNA standardi zaodređivanje veličine DNA fragmenata na gelu agaroze upotrijebljeni su DNA veličinskistandard VII (Roche) raspona od 359 do 8576 bp i veličinski standard IX (Roche)raspona od 50 do 1300 bp. DNA fragmenti su bojani etidij bromidom koji se specifičnoveže na nukleinske kiseline interkalirajući se između dušičnih baza. Bojanje jeprovedeno tako da je gel uronjen u otopinu etidij bromida u 0,5 x TBE puferu (5µg/ml)te je tako ostavljen kroz 25 minuta. Gel je zatim ispran vodom i stavljen podultraljubičasto svjetlo transiluminatora (Sigma® T-2202) gdje je fotografiran.25