Bedeutung des C-reaktiven Proteins im Rahmen maligner ...

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CD14-markierte Dynabeads (Dynal®, Oslo, Norway) eingesetzt. Hierbei handelt es sich um
magnetische Partikel, welche befähigt sind, Monozyten zu binden.
Weiteres Vorgehen:
− Zellen mit 25 ml PBS mischen, Zentrifugation 10 min, 1000 UpM, 4 °C
− Überstand verwerfen und dem verbleibendem Pellet jeweils 4 ml RPMI 1640-Medium
zufügen, resuspendieren und in Zellkulturflaschen überführen (zusätzlich 1 ml Medium
zum Ausspülen zusetzen)
− Brutschrank über 30 min bei 37 °C (Monozyten setzen sich am Boden ab)
– Kulturflascheninhalt vorsichtig in ein Zentrifugenröhrchen abkippen, Zentrifugation 10
min, 1000 UpM, 4 °C
− Überstand abkippen und mit 6 ml PBS resuspendieren
− 250 µl CD14-markierter Dynabeads (Dynal®, Oslo, Norway) hinzufügen und für 15
min. in Magnethalter halten
− Flüssigkeit in neues Zentrifugenröhrchen überführen und mit 1000 UpM bei 4 °C
abzentrifugieren
− Überstand abkippen und mit 1 ml RPMI-Medium mischen
− jeweils 25 µl Lösung in ein Eppendorf-Gefäß geben und mit Tryptanblau mischen
− Zellzahl ermitteln in der Neubauer Zählkammer und mit Medium auf 10 5 /ml einstellen
− beschriftete 24-Lochplatten mit je 20 x 500 µl Suspension bestücken (eine Lochplatte
sowie
pro Proband), Inkubation für 6, 12, 24 und 48 Stunden, ohne Stimulation und
Stimulation mit LPS 1 µg/ml, IL-1α 4 µg/ml, IL-6 1000 U/ml und TNFα 50 U/ml
− 100 µl in Cytospins pipettieren (jeweils eine Positiv- und Negativkontrolle pro
Proband) und 5 min bei 70 UpM zentrifugieren
Die Cytospin-Präparate standen nach dem Lufttrocknen über 24 Stunden der
immunhistochemischen Färbetechnik zur Verfügung.
Zur molekularbiologischen Untersuchung wurde der Lochplatteninhalt nach einem
entsprechenden Zeitintervall von 6, 12, 24 und 48 Stunden resuspendiert und in einem
Eppendorf-Gefäß für 5 min bei 2000 UpM zentrifugiert. Der Überstand konnte vorsichtig
abpipettiert und verworfen werden. Das Zellpellet verblieb im Reaktionsgefäß und wurde mit