Bedeutung des C-reaktiven Proteins im Rahmen maligner ...

21
Subtyp wie der Primärantikörper dar, besaß jedoch eine andere Spezifität. Letzte drei Schnitte
dienten der Negativkontrolle (neg I, II und III) durch Zugabe von 2%-igem BSA/TBS. Die
Inkubation wurde in einer feuchten Kammer bei Raumtemperatur vorgenommen, um
sicherzustellen, dass die Präparate nicht austrocknen.
Nach der 30-minütigen Inkubation wurden sämtliche Schnitte in TBS gewaschen. Es war
darauf zu achten, die Objektträger feucht zu halten und es wurde unverzüglich mit der
folgenden Inkubation begonnen.
In einem zweiten Arbeitsschritt wurde eine Lösung aus dem sekundären oder
Brückenantikörper (polyklonaler Kaninchen-anti-Maus-Antikörper) und dem
Verdünnungspuffer 2, einer Kombination aus AB-Serum (Serum von Blutspendern mit der
Blutgruppe AB) und TBS im Verhältnis 1:4, in einer Konzentration von 1:100 hergestellt.
100 µl wurden dann auf jeden Schnitt gegeben, ebenfalls 30 Minuten in einer feuchten
Kammer belassen und hiernach in TBS gespült.
Der dritte Schritt diente der Inkubation mit dem Tertiär-Antikörper, dem so genannten
APAAP-Komplex, welcher in einer Konzentration von 1:100 mit dem Verdünnungspuffer 1
(2%-igem BSA/TBS) vermischt wurde. Nach einer 30-minütigen Inkubation aller Proben in
der feuchten Kammer konnten diese in TBS gewaschen werden.
Hiernach wurde die Inkubation mit Sekundärantikörper (polyklonaler Kaninchen-Anti-Maus-
AK) und APAAP-Komplex zweimal wiederholt, jedoch blieben die Präparate nur für jeweils
10 Minuten im feuchten Milieu.
Herstellung der Färbelösung:
Lösung 1 wurde in einem 100 ml-Becherglas angesetzt und auf dem Magnetrührer vermischt:
� 18 ml Propandiolpuffer (0,2 M 2-Amino-2-2-methyl-propan 1,3diol (0,05 M) als Pulver
(Merck))
� 50 ml Tris-Puffer (0,05 M), pH 9,7 (0,037 M)
� 28 mg Levamisole (0,41 g/l) (Sigma)
� [0,6 g NaCl (0,15 M)]
Lösung 2 wurde der Lösung 1 hinzu gegeben:
� 35 mg Naphthol-AS-BI-Phosphat (Sigma)
� 420 µl N,N-Dimethylformamid (Merck)