Bedeutung des C-reaktiven Proteins im Rahmen maligner ...

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Transfer von Phospatgruppen in organischen Estern, wobei die P-O-Bindung zerbrochen
wird. Bei der Färbung selbst wird ein Naphtholphosphatester als Substrat verwendet (z.B.
Naphthol-AS-BI-Phosphat), welches zu Phenolkomponenten und Phosphaten hydrolysiert
wird. Die Phenole reagieren dann mit farblosen Diazoniumsalzen, so genannten
Chromogenen, (z.B. Neufuchsin) und bilden unlösliche Azofarbstoffe. So können in einem
kräftigen Rot die entsprechenden Antigen-Antikörper-Komplexe sichtbar gemacht werden.
Letztendlich bietet es sich an, zur Kontraststeigerung eine Gegenfärbung mit einem blauen
Farbstoff (z.B. Hämatoxylin) anzufertigen. Mit Hilfe des Lichtmikroskops ist es möglich,
derartig gefärbte Schnitte in ihrer Morphologie und ihren immunologischen Begebenheiten zu
beurteilen. Die APAAP-Methode diente als Nachweis von CRP in den Präparaten der Niere.
2.7.1 Herstellung von Gefrierschnitten
Hierzu wurde das bei -80 °C eingefrorene Material im Kryostat bei -20 °C in 4 - 5 µm dicke
Schichten geschnitten, auf Objektträger gebracht und anschließend über Nacht (24 h) bei
Raumtemperatur luftgetrocknet. Sofern die Präparate nicht sofort weiterverarbeitet worden
sind, wurden diese wiederum bei einer Temperatur von -80 °C in Aluminiumfolie verpackt
eingefroren.
Um die Gewebeschnitte zu fixieren, wurden diese in gefrorenem Zustand für 10 min in einer
Küvette mit 4 °C kaltem Aceton-TBS getaucht und anschließend luftgetrocknet. Danach
konnte mit der immunhistochemischen Färbung begonnen werden.
2.7.2 Antikörper und Isotyp-Kontrolle
Primärantikörper: Monoklonales Anti-Human CRP, Maus IgG1, Clone CRP-8. Der
Antikörper erkennt ein Epitop der 24 kD Untereinheit von denaturiertem und reduziertem
CRP, er reagiert ebenfalls mit nativem CRP (Sigma, USA), Aufbewahrung bei 2 - 8 °C,
Verdünnung 1:1000 für Gefrierschnitte.
Isotyp-Kontrolle: Gereinigtes Maus IgG1 (kappa), (BD Pharmingen Bioscience, Heidelberg),
gleiche Konzentration wie Primärantikörper, Verdünnung 1:1000
Sekundärantikörper: Gereinigtes Kaninchen-Anti-Maus-Immunglobulin aus Kaninchen-
Antiserum (2.7 g/l), reagiert mit allen Maus-Immunglobulin-Subklassen (Dako),
Aufbewahrung bei 2 - 8 °C, Verdünnung 1:100
Tertiärantikörper: APAAP Maus Monoklonal, IgG1 (kappa), 0,1 g/l, Komplex aus
intestinaler Alkalischer Phosphatase von Kälbern und monoklonaler Maus Anti-Alkalischen
Phosphatase (Dako), Verdünnung 1:100