Bedeutung des C-reaktiven Proteins im Rahmen maligner ...

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Lösung 3 wurde mit den Lösungen 1 und 2 auf dem Magnetrührer vermischt und mit 1 M
HCl auf einen pH von 8,7 eingestellt
� 140 µl 5 % Neofuchsinlösung (in 2 M HCl) (Chroma, Münster)
� 350 µl 4 % Natriumnitrit (Sigma)
Aufgrund der geringen Stabilität von Naphthol-AS-BI-Phosphat und Neofuchsin mussten die
Lösungen nach ihrer Herstellung innerhalb einer Minute verbraucht werden. Die Lösung
wurde auf die in einer Küvette befindlichen Präparate filtriert und hier für 15 Minuten
belassen. Nach dem Abkippen der Färbung und kurzem Spülen der Objektträger mit kaltem
Leitungswasser wurden die Präparate mit 4%-iger Formalinlösung (Formaldehyd) über zwei
Minuten fixiert. Nach abermaligem Spülen mit fließendem Leitungswasser erfolgte eine
Gegenfärbung mit Hämatoxylin über drei Minuten. Anschließend wurden die Objektträger für
10 Minuten mit warmem Leitungswasser gespült, danach mit Aquatex® (Glycerin-Gelatine)
eingedeckt und abschließend mit einem Deckglas verschlossen.
Das APAAP-Verfahren wurde analog zu den Gewebeschnitten auch mit den angefertigten
Lab-Teks der Tumorzelllinien (CRP als Positivkontrolle, Isotyp und Negativkontrolle) und
den Cytospinpräparaten für die Lymphozyten des peripheren Blutes (Positiv- und
Negativkontrolle) durchgeführt.
2.8 Quantitative real-time Polymerasekettenreaktion (PCR)
2.8.1 Reagenzien
� RNA-Isolations-Kit (inklusive Lysispuffer): RNeasy Mini Kit (Quiagen, Hilden)
� QIAshredder TM spin columns (Qiagen)
� TaqMan TM Universal PCR Master Mix (2x) (PE Applied Biosystems, Weiterstadt)
� Random Hexamer Primer (50 ng/ml, Stammlösung 3 µg/µl, Gibco BRL, Karlsruhe)
� First-Strand Buffer (Gibco BRL)
� dNTP-Mix (Ultrapure dNTP-Set: 2'-Deoxyadenosine 5'-Triphosphat (dATP), 2'-
Deoxythymidine 5'-Triphosphat (dTTP), jeweils in der Konzentration 100 mM Lösung,
pH 7,5, Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg)
� DTT 0,1 M (Gibco BRL)
� RNase-Inhibitor; 20 U/µl (PE Applied Biosystems, Weiterstadt)
� Superskript II (RT); 200 U/µl (Gibco BRL)
� Ultrapure TM 0,1 micron filtered (destilliertes Wasser, Dnase / RNase-frei) (Gibco BRL)
� Ethanol 99 % (Apotheke des UKL)