Bedeutung des C-reaktiven Proteins im Rahmen maligner ...

2.8.2 Probenvorbereitung
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Bei der Arbeit mit genetischer Substanz wurden grundsätzlich Einmalhandschuhe getragen
und autoklavierte Reagenzgefäße verwendet. Als Arbeitsplatz diente ein speziell hierfür
vorgesehener Pipettiertisch, um eine Kontamination mit Fremd-RNA zu vermeiden.
Um sowohl die Nierenbiopsien als auch gezüchtete Tumorzellen und gewonnene
Lymphozyten des peripheren Blutes der RNA-Isolierung zugänglich zu machen, bedurfte es
der Einbringung in den Lysispuffer RLT zur RNA-Freisetzung und der Zugabe von
reduzierend wirkendem β-Mercaptoethanol. Der Lysispuffer enthielt GITC
(Guanidinisothiocyanat), ein Salz, welches unter anderem zur RNase-Inaktivierung beiträgt.
Beide Substanzen wurden im Verhältnis 1:100 in einem 1,5 ml Reagenzgefäß (Mikrotube)
angesetzt und dienten, nach Zugabe der Biopsiezylinder direkt nach Entnahme oder einem
bereits vorbereitetem Zellpellet, als Einfriergrundlage. Sofern die Proben nicht sofort
weiterverarbeitet worden sind, wurden diese bei -80 °C aufbewahrt.
2.8.2.1 Isolierung der RNA
Zunächst wurden die Proben bei 30 °C aufgetaut. Biopsien wurden zusätzlich in einer
Qiashredder spin column homogenisiert, indem jede Probe vollständig auf die Säule pipettiert
wurde, um anschließend bei 14000 UpM über 2 Minuten zentrifugiert zu werden. Dieser
Vorgang bewirkte die Scherung der Desoxyribonukleinsäuren (DNA). Die Säule konnte
hiernach verworfen werden.
Folgende Arbeitsschritte galten für alle Proben und wurden mit dem RNeasy Mini Kit-System
(Qiagen) durchgeführt. Zur RNA-Anreicherung wurden Säulen mit einer Membran aus
Silika-Gel eingesetzt.
Den homogenisierten Proben (600 µl) wurden im Verhältnis 1:1 70%-ige Ethanollösung
zugegeben und vermischt. Anschließend wurden 600 µl der Probe in eine RNeasy mini spin
column pipettiert. Während der 15-sekündigen Zentrifugation bei 14000 UpM wurde die
RNA an die Silika-Gelmembran gebunden und die abgepresste Restflüssigkeit im
Sammeltube konnte ebenso wie in den folgenden Waschvorgängen verworfen werden. Dieser
Schritt wurde mit der restlichen Probe wiederholt. Durch Zugabe von 700 µl Buffer RW1,
eines chaotropen Salz- und ethanolhaltigen Waschpuffers, wurde die Membran der RNeasy
spin columns gereinigt und von Inhibitoren befreit. Hierzu erfolgte ebenfalls eine kurze
Zentrifugation von 15 Sekunden bei 14000 UpM. Nun konnten die Säulen auf neue 2 ml-
Sammeltubes umgesetzt werden und mit 500 µl Buffer RPE (ethanolhaltiger Waschpuffer)