Bedeutung des C-reaktiven Proteins im Rahmen maligner ...

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Analog zur CRP-Sonde wurde auch hier der Quencher-Farbstoff TAMRA (6-Carboxy-
tetramethyl-rhodamin) an die Sonde für HPRT gekoppelt, jedoch verfügte diese über den
Fluoreszenzfarbstoff FAM (6-Carboxy-Fluorescin). Die Reaktionen für CRP und HPRT
wurden als Multiplex-PCR in gleichen Reaktionsgefäßen durchgeführt.
Tabelle 1:
Sequenzen der Primer und Sonden zum Nachweis von CRP- und HPRT-spezifischer cDNA
CRP
HPRT
Oligonukleotid Sequenz (5´� 3´)
Forward
Primer
gAA CTT TCA gCC gAA TAC ATC TTT T
Reverse
Primer
CCT TCC TCg ACA TgT CTg TCT
Sonde VIC – Cag gCC CTT gTA TCA CTg gCA gCA gg - TAMRA
Forward
Primer
AgT CTg gCT TAT ATC CAA CAC TTC g
Reverse
Primer
gAC TTT gCT TTC CTT ggT CAg g
Sonde FAM – TTT CAC CAg CAA gCT TgC gAC CTT gA - TAMRA
2.8.4.2 Hep3B-Zellen
Die Verwendung der zur CRP-Produktion stimulierten humanen Hepatom-Zelllinie Hep 3B
[Aden et al., 1979] als Kalibrator für die quantitative real-time PCR wurde durch die
freundliche Unterstützung von Prof. Dr. med. W. Jelkmann, Institut für Physiologie des
Universitätsklinikum Lübeck, möglich gemacht.
2.8.4.3 Reaktionsansätze für die real-time PCR
Die notwendigen Reagenzien wurden als gemeinsamer Mastermix mit einem Gesamtvolumen
von 23 µl je Probe angesetzt. Der Mastermix enthielt sowohl die benötigte Ampli Taq Gold
DNA Polymerase und dNTPs mit dUTP als auch die passive Fluoreszenzfarbstoff-Referenz
ROX und optimale Puffer-Komponenten. Erst kurz vor Einsatz in das TaqManCycler
wurden dem Mastermix 2 µl cDNA hinzugefügt, so dass ein Endvolumen von 25 µl zugrunde
lag.
Mastermix (25 µl):
� 12,5 µl TaqMan Universal PCR Master Mix (2x)
� 0,75 µl CRP forward primer (300 nM)
� 0,75 µl CRP reverse primer (300 nM)
� 0,75 µl CRP probe (300 nM)