Bedeutung des C-reaktiven Proteins im Rahmen maligner ...

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benetzt werden. Dieser Vorgang wurde nach kurzer Zentrifugation (15 sec bei 14000 UpM)
zum Waschen (Entfernen der chaotropen Salze von RW1) und Verwerfen des Überstandes
wiederholt. Eine Zentrifugation über 2 Minuten bei 14000 UpM führte zum Trocknen der
RNeasy-Membran und Entfernen des Ethanols aus RPE. Hiernach wurden die RNeasy spin
columns vorsichtig in neue 1,5 ml-Sammeltubes umgesetzt. Dabei durfte die Säule nicht mit
dem zu verwerfenden Überstand in Kontakt kommen. Als letztes wurden 40 µl Rnase-freies
Wasser, welches auf 70 °C erhitzt worden war, direkt auf die Silikagelmembran pipettiert.
Die fünfminütige Inkubation bei Raumtemperatur und abschließende einminütige
Zentrifugation bei 10000 UpM führte schließlich zum Eluieren der RNA.
2.8.2.2 Konzentrationsbestimmungen der RNA
Um die isolierte RNA photometrisch bestimmen zu können, wurden die Proben (10 µl RNA)
im Verhältnis 1:80 mit DNase- und RNasefreiem Wasser gemischt und in einer Quarzglas-
Küvette gegen einen auf Null abgeglichenen Leerwert (800 µl DNase- und RNasefreies
Wasser) am LKB Ultrospec III Spectrophotometer (Deuterium-Lampe) gemessen. Das RNA-
Extinktionsmaximum wurde bei einer Wellenlänge von 260 nm abgelesen. Um die Reinheit
des RNA-Gehaltes zu ermitteln, erfolgte eine zusätzliche Messung bei 280 nm, da diese
Wellenlänge der Protein-Extinktion entsprach. Aus den Messwerten ließ sich die
Konzentration der RNA (in µg/ml) in den Proben berechnen. Hierzu wurden die
Extinktionswerte mit dem Verdünnungsfaktor 80 und einem Faktor 40, der den spezifischen
Extinktionskoeffizienten von einzelsträngiger RNA (A260 ssRNA) berücksichtigt,
multipliziert.
Lag eine RNA-Konzentration von über 50 µg/ml vor, so wurde sie durch Verdünnung mit
DNase- und RNasefreiem Wasser auf den genannten Wert eingestellt. Eine Betrachtung des
Verhältnisses von RNA zu Proteinkonzentration geschah durch die jeweilige Bildung des
Quotienten aus RNA- und Proteinkonzentration (A260 / A280), der Werte zwischen 1,5 und
2,0 annehmen sollte. Im Anschluss an die Konzentrationsbestimmung wurde die vorliegende
RNA unmittelbar in komplementäre DNA (cDNA) umgeschrieben.
2.8.3 Durchführung der reversen Transkription
Jeweils insgesamt 30 µl der vorhandenen RNA-Probe wurden in komplementäre DNA
(cDNA) umgeschrieben. Um die Anlagerung der Primer zu ermöglichen, wurden der RNA-
Probe 3 µl Random Hexamer Primer zugesetzt und der so entstandene Annealing-Mix bei 70
°C in einem Thermoblock zehn Minuten inkubiert. Nach anschließender kurzer (1 min)