Bedeutung des C-reaktiven Proteins im Rahmen maligner ...

� 0,15 µl HPRT forward primer (60 nM)
� 0,15 µl HPRT reverse primer (60 nM)
� 0,25 µl HPRT probe (100 nM)
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� 7,7 µl UltraPure 0,1 micron filtered (Dnase-, Rnase-frei)
� 2 µl Template (cDNA)
Der durch Pipettieren und Rüttlervibrationen durchmischte Mastermix wurde in die PCR-
Reaktionsgefäße verteilt. Die luftfreie Zugabe der cDNA (2 µl/Reaktionsgefäß) erfolgte nach
kurzer Zentrifugation der Proben.
Während jeder molekularbiologischen Bestimmung wurde eine Negativkontrolle mit DNase-
und RNase-freiem Wasser (UltraPure 0,1 micron filtered) mitgeführt sowie die als
Kalibrator und Positivkontrolle geeigneten Hep3B-Zellen eingesetzt. Alle Ansätze wurden als
Doppelbestimmung durchgeführt. Die PCR-Reaktionsgefäße wurden nach Verschluss mittels
optical caps in den TaqManCycler eingesetzt.
2.8.4.4 Reaktionsbedingungen und Ablauf
Zu Beginn der PCR erfolgte die Aktivierung der Taq-Polymerase AmpliTaq Gold durch
zehnminütige Inkubation bei 95 °C. Die über 45 Zyklen verlaufende DNA-Synthese erfolgte
über verschiedene Stufen. Zum einen umfasste der Ablauf eine Temperaturerhöhung auf 95
°C für jeweils 15 Sekunden zur Denaturierung doppelsträngiger DNA, zum anderen das
Hybridisieren der Primer (annealing) bei niedrigerer Temperatur (62 °C) für 60 Sekunden
und zeitlich verknüpft die Synthese neuer komplementärer DNA-Stränge durch Anlagerung
von dNTPs (primer extension). Am Ende der Amplifikation kühlte das System auf 25 °C ab.
2.8.4.5 Relative Quantifizierung der cDNA
Während der Amplifikation der cDNA wurde durch das real-time PCR-Verfahren die
Vervielfältigung der Zielsequenz in jedem Zyklus quantitativ gemessen. Bei der relativen
Quantifikation werden Änderungen der Gen-Expression in einer Probe in Relation zu einer
anderen – nicht von ihr abhängigen oder regulierten – Referenzsubstanz gesetzt. Die aktive
Referenz, wie HPRT, stellte eine endogene Amplifikationskontrolle dar, welche ko-
amplifiziert wurde. HPRT wird konstant exprimiert und unterliegt keinen
Regulationsmechanismen. Die Nutzung einer passiven Referenz, wie der im Mastermix
enthaltene Farbstoff ROX, ermöglicht es auch PCR-unabhängige Fluktuationen der