Bedeutung des C-reaktiven Proteins im Rahmen maligner ...

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Abkühlung im Gefrierschrank bei -20 °C wurde das Kondensat durch zehnsekündige
Zentrifugation gesammelt. Dem Annealing-Mix wurden letztlich folgende Substanzen für die
reverse Transkription zugegeben:
� 12 µl First Strand Buffer
� 3 µl dNTP-Mix
� 1,2 µl DTT (0,1 M)
� 9,6 µl DNase- und RNasefreies Wasser (UltraPure 0,1 micron filtered)
� 1,8 µl 4 °C kalter RNase-Inhibitor (20 units/µl)
� 3 µl 4 °C kaltes Superscript II (RT)
Das entstandene Gesamtvolumen von 63,6 µl wurde in drei Reagiergefäße portioniert
aufgeteilt bei 37 °C für eine Stunde inkubiert und schließlich entweder bei -80 °C eingefroren
oder mittels PCR gemessen.
2.8.4 Quantitative real-time PCR
Das genetische Material aus Nierenstanzbiopsien, Tumorzelllinien oder Lymphozyten wurde
mittels quantitativer real-time PCR (TaqMan PCR) amplifiziert und mit dem ABI PRISM
7700 Sequence Detection System durchgeführt. Die PCR-Vorbereitung wurde in einem
anderen Raum als die PCR selbst durchgeführt, um eine Kontamination zu vermeiden.
Ebenso wurde mit Einmalhandschuhen unter einer sterilen Werkbank gearbeitet, die zuvor
mittels UV-Bestrahlung von Fremd-DNA befreit wurde.
2.8.4.1 Primer und Sonden
Als Startermolekül für die eingesetzte Taq-Polymerase wurden synthetisch hergestellte
einzelsträngige Oligonukleotide (RNA), so genannte Primer verwendet. Diese waren mit
einer Länge von 21 bis 25 Nucleotiden der gesuchten DNA-Sequenz zwischengeschaltet.
Primer, deren Sequenzen spezifisch für CRP waren, bildeten die Grundlage für eine ebenso
spezifische cDNA Detektion (Primer von TIB MOLBIOL, Berlin, eingestellt auf 10 µM).
Innerhalb der durch die Primer festgelegten Grenzen hybridisierte die mit einem Quencher
(TAMRA)- und Reporter (VIC)-Farbstoff markierte, für CRP spezifische Sonde (PE Applied
Biosystems).
Als interne Amplifikations-Kontrolle wurde das Gen der Hypoxanthinphosphoribosyl-
Transferase (HPRT) verwendet [Moniotte et al., 2001]. Entsprechende Primer und Sonden
wurden freundlicherweise von Herrn Prof. Dr. H.-D. Volk, Berlin, zur Verfügung gestellt.