28° Congresso Internazionale ICOH - Giornale Italiano di Medicina ...

204 G Ital Med Lav Erg 2006; 28:2
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conditions of the sample. 40 urine samples have been collected from
workers exposed to benzene, both smokers and not smokers, and for
each sample the percentage of SPMA measurable at pH 2 and
without pH correction (free SPMA) has been calculated with respect
to the SPMA measured after quantitative hydrolysis, with the
objectives to determine if a correct assessment of the exposure
requires the determination of total SPMA and which concentration
value could correspond to the BEI of 25 µg/g of creatinine
established by the ACGIH. An aliquot of the urine samples has been
treated with 9M H 2 SO 4 , a second one is brought to pH 2 and a third
one is analyzed as it is. All samples are analyzed by HPLC/MS/MS
in negative ions/MRM mode, and quantitative analysis is performed
using the internal standard method. The percentage found in
samples treated at pH 2 is on average 45% of the total SPMA for
smokers and 60% for non smokers, while the free SPMA varies from
1% to 66% due to the urine pH variability and to the lower
concentrations detected. The determination of total SPMA allows the
standardization of the preanalytical factors and the dosage with
analytical methods less sensitive than HPLC/MS/MS.
Key words: benzene, occupational exposure, biological monitoring,
S-phenylmercapturic acid, pre-SPMA, urine pH.
INTRODUZIONE
L’acido S-fenilmercapturico (SPMA) è uno degli indicatori
biologici proposti dall’ACGIH per la valutazione
dell’esposizione professionale a benzene, con un valore
limite di 25 µg/g di creatinina nell’urina di fine turno
(1). Studi effettuati su soggetti esposti a benzene lamentano
una mancanza di correlazione fra la concentrazione
ambientale di benzene e i risultati del monitoraggio
biologico (2). Una possibile causa è l’esistenza nelle
urine di N-acetyl-S (1,2-dihydro-2-hydroxyphenyl)-Lcysteine,
un precursore dell’SPMA (pre-SPMA) che può
essere trasformato in quest’ultimo per idrolisi acida
(3,4). La trasformazione quantitativa del pre-SPMA in
SPMA avviene per trattamento con H 2 SO 4 9M, mentre a
pH superiori è parziale.
Nei metodi analitici utilizzati per la determinazione
dell’SPMA urinario il pH non è considerato un fattore
critico. In alcuni il campione di urina viene acidificato
intorno a pH 2 (5), mentre in altri viene utilizzato acido
acetico al 10% nel corso della SPE (6). Quindi la quantità
di SPMA misurato che dipende dal grado di idrolisi,
varia in funzione del pH iniziale e delle
modalità di conservazione e trattamento
del campione di urina. Gli obiettivi del presente
lavoro sono: analizzare campioni di
soggetti esposti a diverse concentrazioni di
benzene per determinare quale sia il rapporto
fra la quantità di SPMA totale (ottenuto
per idrolisi quantitativa), quella ottenuta
per acidificazione del campione a pH
2 e quello libero; valutare se per una corretta
misura dell’esposizione a benzene sia
indispensabile effettuare la determinazione
dell’SPMA totale e quale sia il valore di
SPMA totale corrispondente al BEI di 25
µg/g di creatinina stabilito dall’ACGIH.
MATERIALI E METODI
I campioni di urina vengono conservati
congelati a -20°C fino al momento dell’analisi.
Un’aliquota 3 ml viene addizio-
nata con 1 ml di H 2 SO 4 9M e dopo 10 min con 1,6 ml di
NaOH 10 M per la determinazione dell’SPMA totale;
una seconda aliquota viene portata a pH 2 con acido acetico
glaciale; una terza utilizzata tal quale fornisce il valore
di SPMA libero. Ai campioni così trattati vengono
aggiunti 30 ng di S-Phenylmercapturic-3,3-d2 acid come
standard interno per l’analisi quantitativa e sono poi
sottoposti ad estrazione in fase solida su cartucce Seppack
C18 da 500 mg precondizionate con 3 ml di metanolo
e poi 3 ml di acido acetico 0,1%. Si lava con 3 ml
acido acetico 0,1% e si eluisce con 3 ml di metanolo. I
campioni vengono analizzati in HPLC/MS/MS con sorgente
Turbo Ion Spray su colonna SUPELCO Discovery
RP C-18 150x4.6 mm, porosità 5 µm. La fase mobile è
un gradiente di metanolo e acido acetico 0,1% da 30:70
v/v a 90:10 v/v, flusso 1 ml/min. La rivelazione è effettuata
in modalità MRM in ioni negativi e le transizioni
monitorate sono 238,1→109,1 per l’SPMA e
240,1→109,1 per lo standard interno. Il tempo di ritenzione
dell’SPMA e dello standard interno in queste condizioni
è di circa 7,7 min. L’analisi quantitativa viene effettuata
mediante una curva di calibrazione ottenuta con
campioni di urina di un volontario non fumatore addizionati
con concentrazioni di SPMA nel range 0,5 - 50
ng/m e contenenti 10 ng/ml di standard interno. Il limite
di rivelabilità e di quantificazione sono rispettivamente
0,02 e 0,05 ng/ml. Con questo metodo sono stati
analizzati 40 campioni di urina prelevati da soggetti sia
fumatori che non, e per ciascuno viene calcolata la percentuale
di SPMA misurata a pH 2 e senza correzione
del pH (SPMA libero), rispetto alla quantità misurata
per idrolisi quantitativa.
RISULTATI
I risultati ottenuti sono riportati nella tabella I.
CONCLUSIONI
La percentuale di SPMA determinata nei campioni
analizzati a pH 2 è quasi il 45% del totale sui soggetti fumatori
con una deviazione standard percentuale del 20%
Tabella I. Quantità medie di SPMA determinate nei 40 campioni analizzati
nelle tre diverse condizioni preanalitiche e loro variabilità
15 SOGGETTI FUMATORI SPMA totale SPMA SPMA
misurato a pH 2 libero
Valore medio 5,74 ng/ml 44,51% 9,58%
CV% —— 21,25 74,17
Valore massimo —— 62,95 28,44
Valore minimo —— 27,23 0,96
25 SOGGETTI NON FUMATORI SPMA totale SPMA SPMA
misurato a pH 2 libero
Valore medio 0,66 ng/ml 58,49% 26,36%
CV% —— 29,19 66,43
Valore massimo —— 97,06 58,82
Valore minimo —— 34,09 5,26