28° Congresso Internazionale ICOH - Giornale Italiano di Medicina ...

206 G Ital Med Lav Erg 2006; 28:2
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gene reporter che codifica per la β-glucuronidasi. L’impiego
di isolati di P. graminea che producono β-glucuronidasi
in esperimenti di infezione artificiale, costituisce
un metodo rapido e semplice per la selezione poiché basato
sulla rivelazione colorimetrica del fungo all’interno
degli embrioni infetti, contrapposto al metodo classico
che comporta la semina dei semi infetti in serra e l’attesa
della comparsa dei sintomi.
MATERIALI E METODI
Uno tra i più virulenti isolati di Pyrenophora graminea,
Dg2 è stato trasformato geneticamente con un gene
reporter che codifica per la β-glucuronidasi (1) . È stato
scelto l’isolato denominato GUS2 come più idoneo allo
screening, poiché ha la stessa capacità di infettare l’ospite
dell’isolato non mutato ed ha un’elevata produzione di
β-glucuronidasi, pari a 13 nmoli MU prodotta (da MUG)
min -1 mg proteina -1 in condizioni standard (2) . Le varietà
di orzo da saggiare sono state infettate artificialmente
con GUS2 con il metodo “sandwich”, che consiste nell’inclusione
di cariossidi di orzo tra due colonie del fungo
cresciuto in piastra e nell’incubazione per due o tre
settimane a 6°C. Dopo 14 o 21 giorni le cariossidi sono
state prelevate ed analizzate. La selezione precoce di varietà
di orzo resistenti alla Striatura bruna è stata effettuata
mediante inoculazione artificiale dell’isolato GUS2
e rilevazione del fungo all’interno degli embrioni infetti
con la colorazione X-gluc (acido 5-bromo-4-cloro-3-indolyl
β-D-glucuronico). Successivamente, i campioni
sono stati analizzati a “fresco” oppure in seguito a destaining
nella serie di etanolo 25%, 50%, 70%, 95% e
100%, mediante stereomicroscopio,
RISULTATI E DISCUSSIONE
Per valutare il grado di infezione della varietà in esame
è stata istituita una scala di infezione. La valutazione
è stata effettuata attribuendo a ogni embrione osservato il
tipo corrispondente alla scala e calcolando la percentuale
di infezione secondo la formula:
n(3) + 0.5 n(2) x 100
––––––––––––––––––
N
dove N rappresenta il numero totale degli embrioni osservati.
Per verificare la validità di questo metodo rispetto
a quello classico di selezione sono stati saggiati diversi
cultivar di orzo a reazione già nota verso il patogeno
(sei varietà di orzo resistenti e cinque varietà suscettibili).
L’analisi è stata ripetuta due volte incubando i semi
con il fungo per due e tre settimane. I risultati, concordi
in entrambe le prove, hanno mostrato che il metodo di
selezione precoce basato sull’isolato GUS2 è in grado di
discriminare varietà di orzo resistenti e suscettibili a P.
graminea come risultano dal metodo classico, ma con un
notevole risparmio di tempo, spazio e materiali (Tab. I).
In seguito a questi risultati, sono state saggiate con questo
metodo innovativo 12 cultivars di orzo dalle caratteristiche
agronomiche utili per la produzione e per questo
correntemente usate in campo. Poiché la reazione di queste
cultivars verso attacchi di P. graminea non è nota le
analisi con il metodo basato su GUS2 sono state affian-
Tabella I. Valutazione della resistenza/suscettibilità a
P. graminea di 11 varietà di orzo con il metodo classico
di inoculo artificiale e con il metodo basato su GUS2
Varietà
Inoculo artificiale Metodo
con Dg2 GUS2
Onice 10-15% 0%
Proctor 10-15% 25%
Rebelle 5% 10%
Fior3485 5% 0%
Fior 3486 5% 0%
Vada 5% 0%
Mirco 80% 70%
Nudinka 80% 50%
Jaidor 80% 80%
Passport 90% 90%
CI6944 90% 50%
cate dal test di patogenicità classico in serra. Il saggio di
patogenicità classico prevede che dopo l’incubazione
con il fungo, i semi siano seminati in terrine in serra fino
a comparsa dei sintomi. Per minimizzare l’eventuale rischio
connesso con l’utilizzo di microrganismi geneticamente
modificati, la prova in serra è stata condotta con
l’isolato selvatico non mutato (Dg2) poiché era stata precedentemente
verificata la sostanziale omologia di virulenza
fra Dg2 e GUS2. In questo modo tutte le prove che
coinvolgono GUS2 sono confinate negli ambienti controllati
dei laboratori. I risultati mostrano che il metodo
GUS2 è paragonabile al metodo classico; secondo il primo
metodo, infatti, le diverse varietà di orzo in esame
hanno circa lo stesso ordine crescente di resistenza
(ranking) ottenuto con il metodo classico. Per alcune varietà
i risultati ottenuti con il metodo GUS2 sono stati anche
confrontati con i risultati dei test di infezione eseguiti
con la popolazione naturale di campo del fungo.
Anche in questo caso il ranking ottenuto con i due metodi
è sostanzialmente paragonabile, confermando la validità
del metodo basato su GUS2.
CONCLUSIONI
L’Italia è tra i più forti consumatori di pesticidi di Europa.
I dati ufficiali parlano di 10 chilogrammi ad ettaro
coltivato come dato medio, che tende a salire enormemente
nelle aree del Nord-Italia con un’agricoltura molto
industrializzata (3) . L’esposizione professionale cronica,
soprattutto in ambienti chiusi quali le serre, costituisce
un problema sanitario rilevante. Inoltre, studi recenti
caso-controllo hanno indicato che il rischio di sviluppare
la malattia di Parkinson tra gli esposti per motivi professionali
a pesticidi, è quasi doppio rispetto al campione
di controllo (4) . L’indirizzo futuro è quindi quello di ridurre,
o dove possibile, eliminare l’impiego di queste sostanze
a favore di metodologie alternative a minore impatto.
Alcune di queste metodiche, come nel caso analizzato,
prevedono l’utilizzo di microrganismi geneticamente
modificati. Lo studio in esame ha permesso di