(19) 대한민국특허청(KR) (12) 공개특허공보(A) - Questel

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어야 하는 병태의 종류 및 중증도에 따라 달라질 수 있다. 임의의 특정 피험자의 경우, 특정 투여 계획은 개체
의 필요 및 조성물 투여를 관리하거나 감독하는 자의 전문가적 판단에 따라 경시적으로 조정되어야 한다. 본
명세서에 제시된 투여량 범위는 예시적일 뿐이며 청구된 조성물의 범위 또는 실시를 제한하고자 하는 것이 아님
을 명심해야 한다.
본원에 기재된 본 발명의 조성물 및 방법의 기타 적합한 변형 및 적합화가 명백하고 본 발명의 범위 또는 본원
에 기재된 양태를 벗어나지 않고서도 적합한 등가물을 사용하여 이루어질 수 있음은 당업자에게 자명할 것이다.
본 발명은 다음의 실시예를 참조하여 보다 명백하게 이해될 수 있을 것이며, 이러한 실시예는 설명하기 위해서
만 포함된 것이지 본 발명을 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
실시예
실시예 1: 항-사람 IL-1β 단클론 항체의 생산
마우스 항-사람 IL-1β 단클론 항체는 다음과 같이 수득된다:
실시예 1.1: 사람 IL-1β 항원에 의한 마우스의 면역화
완전 프로인트 보조제 또는 Immunoeasy 보조제(Qiagen, Valencia, CA)와 혼합된 재조합 정제된 사람 IL-1β
(R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) 20㎍을 5마리의 6 내지 8주령 Balb/C, 5마리 C57B/6 마우스 및 5마리 AJ
마우스에게 1일째 피하 주사한다. 24일째, 38일째 및 49일째, 불완전 프로인트 보조제 또는 Immunoeasy 보조제
와 혼합된 재조합 정제된 사람 IL-1β 변이체 20㎍을 동일한 마우스에게 피하 주사한다. 84일째 또는 112일째
또는 144일째, 재조합 정제된 사람 IL-1β 변이체 1㎍을 정맥내 주사한다.
실시예 1.2: 하이브리도마의 생성
실시예 1.1에 기재된 면역화된 마우스로부터 수득한 비장세포를 SP2/O-Ag-14 세포와 5:1의 비율로 문헌[참조:
Kohler, G. and Milstein, (1975) Nature, 256: 495]에 기재된 확립된 방법에 따라 융합시켜 하이브리도마를
생성한다. 융합 산물은 96웰 플레이트 중의 아자세린 및 하이포크산틴 함유 선택 배지에 웰당 2.5x10 6
비장 세
포의 밀도로 평판배양한다. 융합 후 7일 내지 10일 동안 하이브리도마 콜로니를 육안 관찰한다. 하이브리도마
콜로니를 함유하는 각각의 웰의 상청액을 IL-1β에 대한 항체의 존재에 대해 ELISA로 검사한다(실시예 3.1에 기
재된 바와 같음). 그 다음, IL-1β 특이적 활성을 나타내는 상청액은 IL-8의 MRC-5 생검에서 IL-1β를 중화시
키는 능력에 대해 시험한다(실시예 3.2에 기재된 바와 같음).
실시예 1.3: 항-사람 IL-1β 단클론 항체의 동정 및 확인
IL-1β에 결합하고 IL-1β에 특이적으로 결합할 수 있고 특히 MRC-5 생검에서 IC50 값이 5nM 이하인 항체를 생산
하는 하이브리도마를 한계희석법으로 증량하고 클로닝한다.
하이브리도마 세포는 10% 이하의 IgG 소 태아 혈청을 함유하는 배지(Hyclone #SH30151, Logan, UT)에서 증대시
킨다. 평균적으로, 각각의 하이브리도마 상청액(클론 집단으로부터 유래함) 250ml를 수확하고, 농축하고, 표준
방법에 의해 단백질 A 친화성 크로마토그래피로 정제한다. IL-1β 활성을 억제하는 정제된 mAb의 능력을 실시
예 3.2에 기재된 바와 같이 MRC-5 생검을 사용하여 측정한다.
실시예 1.4: 각각의 쥐의 항-사람 IL-1β 단클론 항체에 대한 가변 영역의 아미노산 서열의 결정
각각의 아미노산 서열 결정을 위해, 약 10x10 6
개의 하이브리도마 세포를 원심분리하여 분리하고, Trizol(Gibco
BRL/Invitrogen, Carlsbad, CA)로 제조업자의 지침에 따라 처리하여 총 RNA를 분리한다. 총 RNA는
SuperScript First-Strand Synthesis System(Invitrogen, Carlsbad, CA)을 시용하여 제조업자의 지침에 따라
제1 쇄 DNA 합성 처리한다. 올리고(dT)는 폴리(A) +
공개특허 10-2012-0104542
RNA를 선택하기 위해 주요한 제1 쇄 합성에 사용한다. 그
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