(19) 대한민국특허청(KR) (12) 공개특허공보(A) - Questel

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다음, 쥐의 면역글로불린 가변 영역의 증폭을 위해 설계한 프라이머(Ig-프라이머 세트, Novagen, Madison, WI)
를 사용하여 제1 쇄 cDNA 산물을 PCR로 증폭시킨다. PCR 산물을 아가로스 겔에서 분리하고, 절제하여, 정제한
후, TOPO 클로닝 키트로 pCR2.1-TOPO 벡터(Invitrogen, Carlsbad, CA)에 서브클로닝하고, TOP10 화학 적격 이.
콜라이(Invitrogen, Carlsbad, CA)에 형질전환시킨다. 형질전환체에 콜로니 PCR을 수행하여 삽입체 함유 클론
을 확인한다. QIAprep Miniprep 키트(Qiagen, Valencia, CA)를 사용하여 플라스미드 DNA를 삽입체 함유 클론
으로부터 분리한다. 플라스미드 중의 삽입체를 양 쇄에 대해 서열분석하여, M13 정방향 및 M13 역방향 프라이
머(Fermentas Life Sciences, Hanover MD)를 사용하여 가변 중쇄 또는 가변 경쇄 DNA 서열을 결정한다. 항-
IL-1β 단클론 항체의 가변 중쇄 및 가변 경쇄 서열를 표 5에 니타낸다.
실시예 2: 재조합 항-사람 IL-1β 항체
실시예 2.1: 재조합 키메라 항-사람 IL-1β 항체의 작제 및 발현
쥐의 항-사람 IL-1β 단클론 항체 1B12.4H4의 중쇄 불변 영역을 암호화하는 DNA는 세균에서 상동 재조합에 의해
2개의 경첩 영역 아미노산 돌연변이를 함유하는 사람 IgG1 불변 영역을 암호화하는 cDNA 단편으로 교체하였다.
이러한 돌연변이는 234번(EU 번호 부여) 위치에서 류신의 알라닌으로의 변화 및 235번 위치에서 류신의 알라닌
으로의 변화이다[참조: Lund et al., (1991) J. Immunol. 147: 2657]. 상기 항체들 각각의 경쇄 불변 영역은
사람 κ 불변 영역으로 교체하였다. pHybE 발현 플라스미드에 결합된 키메라 중쇄 및 경쇄 cDNA의 동시형질감
염으로 전장 키메라 항체를 HEK 293-6E 세포에서 일시적으로 발현시켰다(미국 특허 출원 공보 제US
2009/0239259호 참조). 재조합 키메라 항체를 함유하는 세포 상청액을 단백질 A 세파로스 크로마토그래피로 정
제하고, 산 완충액을 첨가하여 결합된 항체를 용출시켰다. 항체를 중화시키고 PBS에 투석하였다.
키메라 1B12.4H4를 암호화하는 중쇄 cDNA를 1B12.4H4 키메라 경쇄 cDNA(둘다 pHybE 벡터에 결합됨)와 함께 HEK
293-6E 세포에 동시형질감염시켰다. 재조합 키메라 항체를 함유하는 세포 상청액을 단백질 A 세파로스 크로마
토그래피로 정제하고, 산 완충액을 첨가하여 결합된 항체를 용출시켰다. 항체를 중화시키고 PBS에 투석하였다.
그 다음, 정제된 키메라 항-사람 IL-1β 단클론 항체는 실시예 3.2에 기재된 바와 같이 MRC-5 세포에 의한 IL-8
의 IL-1β 유도 생산을 억제하는 능력에 대해 시험하였다.
실시예 2.2: 사람화된 항-사람 IL-1β 항체의 작제 및 발현
실시예 2.2.1: 사람 항체 골격의 선택
VH 및 VL CDR의 정준 구조를 문헌[참조: Huang et al., (2005) Methods 36: 35-42]의 방법에 따라 결정하였다.
정준 구조에 근거하여, 적당한 수용체 사람 VH 골격 서열은 3-13, 3-53, 3-66, 4-34 및 4-59이었고, 적당한 수
용체 사람 VL 골격 서열은 Vk1, 일부 Vk3, Vk5 및 Vk6 하위그룹을 포함하였다. hJH1-6 서열을 갖는 1B12VH 영
역의 아미노산 109-122의 정렬에 근거하여 hJH4를 수용체 사람 FR4 서열로서 선택하였다.
CDR 또는 골격 잔기를 "X"로 점진적으로 대체하여 4개의 추가의 VH 서열(1B12VHx, 1B12VHxx, 1B12VHxxx 및
1B12VHxxxx)을 생성하였다. 1B12VH는 D 및 J 영역이 제거된 VH 서열이었다. Vector NTI
공개특허 10-2012-0104542
소프트웨어의 Align X 프로그램(Invitrogen, Carlsbad, CA)으로 5개의 서열을 사람 VH 서열과 나란히 정렬하
였다. 루프 형태 및 VH/VL 경계면에 중요한 전반적인 골격 또는 특정 잔기만에 집중하면, VH4-59는 1B12VH 서
열과 전반적으로 가장 좋은 상동성을 가졌다. 1B12VH CDR 서열을 이식하기 위한 수용체 사람 생식계열 골격으
로서 상기 골격을 선택하였다. 상이한 VH 계열로부터 대체 수용체 사람 골격으로서 VH3-53을 선택하였다. VH4
서열을 정렬하여, 사람화된 서열의 면역원성 가능성을 최소화하기 위해 VH4 공통 서열로 변화될 수 있는 VH4-59
의 골격 잔기를 확인하였다. VH4-59의 서열 정렬에 의해, VH4-59를 VH4 공통 서열로의 골격 잔기 변화를 도입
할 필요는 없는 것으로 나타났다. 서열 정렬에 의해, 수용체 골격으로서 사용되는 VH4-59 서열은 우세한 공통
서열인 것으로 나타났다. 마찬가지로, 모든 VH3 서열을 정렬하여, 면역원성 가능성을 최소화하기 위해 VH3 공
통 서열로 변화될 수 있는 VH3-53의 골격 잔기를 확인하였다. 2개의 VH3 공통 서열 변화(I12V 및 V29F)가 확인
되었다. 또한, 정렬에 의해, 수용체 골격으로서 사용되는 VH3-53 서열은 3개의 공지된 VH3-53 다형태로부터의
제1 서열인 것으로 나타났다. Q1E 변화가 있거나 없는 모든 조합에서 9개의 제안된 역돌연변이 중에서 1 내지
8개를 갖는 세트 1의 서열은 면연원성 가능성이 덜하거나, VH4-59 생식계열 서열로부터의 자연 발생 사람 VH 서
열과 전반적으로 가장 좋은 동일성을 갖는 추가의 사람화된 1B12VH 서열을 생성하기 위해 이루어질 수 있다.
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