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Tabela 1. Lista parcial de BAL e suas bacteriocinas. Linhagem produtora Lactococcus lactis subsp. lactis Lactobacillus reuteri Lactobacillus sakei Lb 706 Lactobacillus sakei 148 Lactobacillus sakei CTC 494 Lactobacillus sakei LTH 673 Lactobacillus sakei Lb 674 e Lactobacillus sakei Lb 16 Lactobacillus sakei MN Lactobacillus sakei 251 Lactobacillus sakei L45, Lactobacillus sakei 148, Lactobacillus sakei V18 Lactobacillus curvatus LTH 1174 Lactobacillus bavaricus Enterococcus faecium CTC 492 Enterococcus faecium DCP 1146 Enterococcus faecium T136 Enterococcus faecium L50 Leuconostoc gelidum A-UAL 187 Leuconostoc mesenteroides TA33a Leuconostoc carnosum B-TA11a Leuconostoc curvatus FS47 Carnobacterium piscicola KLV17B Carnobacterium piscicola JG126 Carnobacterium divergens 750 Pediococcus acidilactici PAC1.0, JD, H, E, F, M, Pediococcus pentosaceus Z102 Pediococcus acidilactici L50 Carnobacterium divergens 750 Carnobacterium piscicola mutante LV17A Carnobacterium piscicola mutante LV61 Fonte: De Martinis et al., 2002. bacteriocina nisina reuterina sakacina A sakacina M sakacina K sakacina P sakacina 674 sakacina MN sakacina B lactocina S curvacina A bavaricina A enterocina A enterocina 1146 enterocinasAeB enterocinas L50A e L50B leucocina A-UAL leucocina TA33a leucocina B-TA11a curvaticina FS47 carnobacteriocinas B1 e B2 piscicolina 126 divergicina 750 pediocina PA1 pediocina L50 divergicina 750 carnobacteriocina A piscicolina 61 ção ter sido devida à produção de ácidos orgânicos ou peróxido de hidrogênio ou a presença de bacteriófagos líticos (De Martinis et al., 2002). As cepas com atividade antagonística isoladas devem ser, em seguida, submetidas a ensaios confirmatórios da atividade inibitória. Entre os métodos para confirmação, podemos destacar os seguintes: a) difusão em poços: os sobrenadantes de culturas supostamente produtoras de bacteriocinas são colocados em orifícios cortados em uma placa de ágar semeado com um organismo sensível (indicador). Durante a incubação, a bacteriocina difunde-se pelo ágar, inibindo o crescimento do indicador e formando um halo ao redor do orifício (Figura 2). Figura 2: Foto de placa de ensaio de diluição crítica para quantificação da bacteriocina 2a produzida por L. sake 2a pelo método da difusão em poços, utilizando L. monocytogenes como microrganismo indicador (Rosa, 2001) b) “flip-streak”: as bactérias teste são semeadas em estrias na superfície de um meio sólido, invertendo-se em seguida esse meio. O organismo sensível à bacteriocina é então semeado no lado inverso do ágar. Durante a incubação, verifica-se a inibição do crescimento do microrganismo sensível (Figura 3). c) “spot-on-the-lawn”: as culturas teste são semeadas como um ponto na superfície de um meio de cultura sólido adequado contendo ágar. Após a incubaçãodessaplaca,adiciona-seuma camada de um indicador sensível, observando-se a inibição de seu crescimento após uma nova incubação (Figura 4a). A sensibilidade do inibidor à enzimas proteolíticas pode ser determinada empregando-se uma modificação da técnica “spot-on-the-lawn”. Nessa técnica, antes de se adicionar a sobre- 116 <strong>Biotecnologia</strong> Ciência & Desenvolvimento - nº 29
Figura 3: Representação esquemática de um ensaio “flip streak” mostrando: (A) cultura produtora de bacteriocina, (B) e (C) culturas sensíveis à bacteriocina, (D) cultura não sensível à bacteriocina camada com o microrganismo indicador, adicionam-se ao meio proteases, além de água destilada como controle negativo (Figura 4b). 4. Mecanismo de ação das bacteriocinas de bactérias láticas. O mecanismo para a atividade das bacteriocinas sobre células vegetativas não está totalmente esclarecido, mas envolve ação sobre a membrana celular. Bacteriocinas pertencentes às quatro classes de Klaenhammer (1993) são capazes de causar o colapso da força próton-motriz em células vegetativas, sugerindo um modo de ação comum, conforme demonstrado por Bruno e Montville (1993). A força próton-motriz está relacionada com um grande número de processos de membrana que envolvem dispêndio energético. A força próton-motriz pode ser expressa como segue: PMF = ∆ψ - Z∆pH onde, PMF= força próton-motriz, ∆ ψ = potencial de membrana, Z=2,3 RT/F, sendo R a constante dos gases, T a temperatura absolutaeFaconstante de Faraday. Há dúvidas, entretanto, se o colapso da força próton-motriz é um evento primário ou secundário e também se a desestabilização da membrana celular ocorre pelo mecanismo de formação de poros ou pela ação detergente. A Figura 5 esquematiza os dois principais mecanismos propostos para o colapso da força próton-motriz. O mecanismo de formação de poros é o mais aceito porque uma solubilização generalizada como conseqüência da ação detergente ocasionaria a lise total das células, levando a um colapso repentino dos parâmetros bioenergéticos, não sendo compatível com a cinética de saturação observada (Montville et al., 1995). Para a formação de poros, há doismodelospropostos,conformeilustrado na Figura 6. No caso da ação da bacteriocina nisina sobre esporos, a germinação é impedida pela reação de grupamentos dehidrobutirina e dehidroalanina com moléculas sulfidrila vitais da membrana, conforme mostrado na Figura 7 (De Martinis et al., 2002). Um fato importante a ser considerado é a possibilidade de aparecimento de células resistentes a bacteriocinas, já observadas entre Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus e Clostridium botulinum (De Martinis et al., 2002). Os mecanismos para resistência a bacteriocinas podem envolver sua destruição por proteases ou uma “bacteriocinase” específica, modificação estrutural ou, ainda, alteração da composição da membrana da célula alvo (Montville et al., 1995). Para diminuir a freqüência do aparecimento de microrganismos resistentes a bacteriocinas em alimentos é necessário o controle da concentração de cloreto de sódio, do pH e da temperatura de armazenamento desses alimentos (De Martinis et al., 2002). 5. Emprego de bacteriocinas em alimentos Apesar do grande número de trabalhos de pesquisa sobre a aplicação de bacteriocinas de BAL em bioconservação, o uso efetivo desses compostos em alimentos ainda é bastante limitado. A nisina é a única bacteriocina disponível comercialmente para utilização em alimentos. Esta bacteriocina é Figura 4: Teste de sensibilidade a proteases referente à cepa Lactobacillus sake 2a (determinado pela técnica “spot-on-thelawn”). a) adição de 20 µLde água destilada estéril adjacente ao ponto de inoculação da bactéria produtora; b) adição de protease (20 µl, 20 mg/mL) e c) adição de α-quimotripsina (20 µL, 20 mg/mL) (De Martinis, 1997) produzida por algumas cepas de Lactococcus lactis subsp. lactis e seu nome é derivado de “group N inhibitory substance”, porque L. lactis anteriormente era classificado como Streptococcus do grupo N de Lancefield. Essa bacteriocina é atóxica, destruída por enzimas digestivas e não confere Figura 5: Interação de monômeros de bacteriocina (formas ovais) com a membrana citoplasmática de acordo com o mecanismo de formação de poros (A) e o modelo de ação detergente (B) (retirado de Montville et al., 1995, com permissão de Elsevier Science) <strong>Biotecnologia</strong> Ciência & Desenvolvimento - nº 29 117
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