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Tabela 04. Fungos endofíticos com potencial para o controle biológico de doenças causadas por fungos e nematóides Endófito Colletotrichum magna Fusarium spp. Neotyphodium spp. Patógeno C. magna Radopholus similis (nematóide) Drechslera sorokiniana; Fusarium graminearum; F. culmorum; Rhizoctonia cerealis e Gaeumannomyces gramini Hospedeiro Citrullus lanatus e Cucumis sativus banana Lolium sp.; Triticum spp. e Festuca arundinacea Referência Redman et al., 1999 Pocasangre et al., 2000 Tunali et al., 2000 introdução de genes heterólogos na planta hospedeira, visto que podem ser, mais facilmente que as plantas, alterados geneticamente e reintroduzidos no hospedeiro conferindo novas características de interesse agropecuário à planta. O primeiro exemplo deste tipo de aplicação ocorreu em milho inoculado com uma linhagem da bactéria endofítica Clavibacterxyli subsp. cynodontis, na qual foi introduzido o gene da endotoxina de Bacillus thuringiensis. Este gene expressa uma proteína cristal, que quando ingerida pela broca do milho (Ostrinia nubilalis), causa a morte do inseto. A inoculação da bactéria endofítica expressando esta proteína tornou as plantas de milho resistentes a esta broca, mostrando a eficiência desta estratégia no controle de pragas (Tomasino et al., 1995). Este gene foi introduzido também em Bradyrhizobium japonicum e após colonização desta bactéria em raízes de Cajanus cajan, a planta hospedeira se tornou resistente à Rivelia angulata (Nambiar et al., 1990). Estratégia semelhante foi utilizada para o controle da broca da cana. Entretanto, foi verificado que o controle desta broca foi mais eficiente quando dois genes heterólogos que codificam a proteína cristal de B. thuringiensis e quitinase de Serratia marcescens que degrada o exoesqueleto da lagarta, foram introduzidos em bactérias endofíticas e estas testadas na dieta da lagarta (Downing et al., 2000). A tecnologia do DNA recombinante também pode favorecer o entendimento da interação endófito-planta, pois permite a expressão de genes marcadores nos microrganismos endofíticos de interesse, facilitando a sua detecção no hospedeiro e permitindo o monitoramento destes organismos na planta e no meio ambiente (Murray et al., 1992; Yates et al., 1999). Este tipo de trabalho permite um estudo da dinâmica da colonização do microrganismo endofítico na planta, favorecendo a utilização destes para o controle de pragas ou doenças. No Departamento de Genética da Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz” (ESALQ/USP) em Piracicaba foram desenvolvidos vetores de expressão de genes heterólogos para as bactérias endofíticas de citros,P.agglomerans, E. cloacae e Methylobacterium spp. Neste trabalho o objetivo principal é expressar um gene de Endoglucanase (EglA) clonado a partir de Bacillus pumilus e que deve estar envolvido na via de degradação de goma xantana e goma fastidiana (Araújo et al., 2001a), as quais são produzidas pelas bactérias fitopatogênicas Xanthomonas campestris e Xylella fastidiosa, respectivamente e que podem estar relacionados a patogenicidade destas bactérias. Dessa forma, espera-se que a expressão destes genes em uma bactéria endofítica de citros, possa reduzir os sintomas destas Tabela 05. Fungos endofíticos com potencial para o controle de biológico de insetos- pragas Endófito Acremonium sp. A. alternatum A. coenophialum A. lolii A. strictum Balansia cyperi Beauveria bassiana Cladosporium shaerosperum Discula quercina Epichloe sylvatica Neotyphodium spp. N. lolii Rhabdocline parkeri Inseto praga Parapediasia teterrella Plutella xylostella Parapediasia teterrella Microctonus hyperodae Trialeurodes vaporariorum Spodoptera frugiperda Ostrinia nubilalis Adelges abietis Besbiscus mirabilis S. frugiperda Blissus leucopterus Listronotus bonariensis Contarinia sp. Referência Koga et al., 1997 Raps & Vidal, 1998 Koga et al., 1997 Barker & Addison (1996) Vidal, 1996 Clay et al., 1985 Wagner & Lewis, 2000 Lasota et al., 1983 Wilson & Carroll, 1997 Brem & Leuchtmann, 2001 Richmond & Shetlar, 2000 Goldson et al., 2000 Sherwoodpike et al., 1986 70 <strong>Biotecnologia</strong> Ciência & Desenvolvimento - nº 29
doenças, que têm causados sérios prejuízos para a citricultura brasileira. MICRORGANISMOS ENDOFÍTICOS NO BRASIL Talvez os primeiros estudos sobre o isolamento de fungos endofíticos foram os de Robrigues (1994) e Rodrigues e Samuels (1992) que isolaram de uma palmeira, o açaí (Euterpe oleracea) várias espécies de fungos, incluindo algumas até aquela época desconhecidas. Os autores salientam o potencial biotecnológico desses microrganismos. Por outro lado, bactérias endofíticas tem sido isoladas de diferentes gramíneas e de outros vegetais, especialmente as bactérias fixadoras de nitrogênio como Glucanoacetobacter diazotrophicus isolada de cana-de-açucar e que mais tarde foi isolada de batata-doce (Cavalcante e Dobereiner, 1989). Uma recente revisão (Baldani et al, 2002) apresenta detalhes sobre bactérias endofíticas fixadoras de nitrogênio ou diazotróficas isoladas no Brasil e seu vasto potencial de utilização na agricultura. A partir de 1990 foram iniciados, nos laboratórios do Departamento de Genética da ESALQ/USP em Piracicaba, pesquisas com fungos endofíticos isolados de plantas tropicais como a leguminosa forrageira Stylosanthes,a bananeira (Pereira, 1993a), o milho (Souza, 1996) e depois a soja (Mendes et al., 2001) citros (Araújo et al. 2001b; Araújo et al. 2002; Glienke- Blanco etal., 2002), cacaueiro e eucalipto entre outros. Os estudos foram, em seguida, ampliados para abranger também a microbiota endofítica bacteriana. Além de mostrar a diversidade microbiana existente nessas plantas (Figuras 02 e 05), aspectos de interesse biotecnológico encontrados nesses microrganismos estão sendo explorados. Como mencionado no item anterior, atenção especial vem sendo dada ao estudo das interações entre endófitos e patógenos de plantas cítricas em uma tentativa do controle biológico de patógenos. Em eucalipto e soja vários endófitos tem tambémsemostradoapropriadospara controle biológico e para promoção de crescimento; outros, tem capacidades de biodegradação de pesticidas e de produzir antibióticos. Trabalhos com endófitos tem sido também realizados em Universidades, entre outras as do Amazonas, de Goiás, Pernambuco, Caxias do Sul e Mogi das Cruzes, com plantas da amazônia, do cerrado e da mata atlântica. As tabelas 06 e 07 apresentam alguns exemplos de estudos realizados no nosso país. Mais recentemente, um amplo estudo integrado sobre a microbiota endofítica de plantas de interesse econômico ou em perigo de extinção como é o caso da samambaia Dicksonia sellowiana, está sendo conduzido graças ao apoio da Fundação de Amparo a Pesquisa do estado de São Paulo (FAPESP). O projeto, coordenado pelo Dr. Itamar Soares de Melo (CNPMA-EMBRAPA, Jaguariúna, SP) tem como objetivos, em um esforço conjunto abrangendo vários grupos de pesquisa, caracterizar e preservar endófitos além de pesquisar o potencial biotecnológico dos mesmos (http:// www.cnpma.embrapa.br/projetos/endofiticos/). Certamente, em pouco tempo, resultados de valor aplicado estarão disponíveis permitindo o uso da biodiversidade microbiana nos mais diversos segmentos da biotecnologia. CONSIDERAÇÕES FINAIS Levando-se em conta que existem aproximadamente 300 mil espécies de plantas já catalogadas e que muitas delas, já estudadas com relação à microbiota endofítica, apresentam até 5 ou mais novas espécies de fungos , pode-se chegar ao número ainda subestimado de um milhão e meio de fungos existentes em nosso planeta. Destes, apenas 4,6% são conhecidos. No ritmo atual de identificação calculase que para que todas as espécies de fungos sejam identificadas, há ainda cerca de 800 anos pela frente (Azevedo, 1998a). Levando-se em conta que o processo co-evolutivo das espécies vegetais se deu lado a lado com esta microbiota endofítica e que as mudanças climáticas ao longo dos milênios levaram a um processo de seleção natural eficiente gerando variabilidade genética para as plantas e microrganismos, as perspectivas abertas para o estudo desta microbiota endofítica são imensas, principalmente no que se refere a estudos biotecnológicos, tanto a nível molecular descobrindo genes importantes ligados ao controle biológico de pragas e doenças, produção de enzimas, biorremediação de compostos tóxicos, como também para a produção de metabólitos secundários de atividades terapêuticas e de grande valor agregado no mercado internacional. Principalmente deve ser levado em consideração, que são ainda em pequeno número as pesquisas com endófitosdeplantastropicaisondedeve se concentrar o maior potencial biotecnológico da área. Muitas empresas e países já perceberam essa potencialidade. Cabe a nós proteger e utilizar em nosso benefício a biodiversidade microbiana não apenas endofítica, mas, toda a microbiota existente em regiões tropicais e subtropicais. AGRADECIMENTOS Os autores agradecem à FAPESP (Proc. n o . 98/16262-2) pelo suporte financeiro constante durante a elaboração deste trabalho e a bolsa de pós doutorado a Welington Luiz de Araújo (Proc. n o . 00/010699-1). REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ALQUATI,S.A.B.Paracoccidioidesbrasiliensis não ocorre na forma endofítica em gramíneas da região endêmica de Botucatu, SP. Brasil. Botucatu, UNESP, 1999, 115p., Dissertação Mestrado. ALVES, S.B. Controle microbiano de insetos. Piracicaba, FEALQ, 1998, 1163 p. ARAÚJO, W.L.; LIMA, A.O.S.; AZEVE- DO J.L.; MARCON, J.; KUKLINSKY- SOBRAL, J.; LACAVA, P.T. Manual: Isolamento de Microrganismos Endofíticos. CALQ, Piracicaba, 86p., 2002a. ARAÚJO,W.L.;LIMA,A.O.S.;MACCHE- RONI JR., W; FUNGARO, M.H.P.; ANDREOTE, F.D.; SOUZA, L.A.; LA- CAVA, P.T.; AZEVEDO J.L. Biological control of plant diseases by endophytic bacteria expressing a heterologous protein from Bacillus sp. In: R. Sheves & J. Macke (Eds.), IUPAC Chemrawn XIV Conference in Green Chemistry, Univ. Colorado, Boulder (eletrônico), 2001a. ª <strong>Biotecnologia</strong> Ciência & Desenvolvimento - nº 29 71
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