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elecimento de protocolos eficientes para o tratamento na fase crônica da doença e ressalta a importância de estudos que visem a favorecer a manipulação imunológica durante a fase aguda da infecção (Costa e cols, 1998). Nos seres humanos, a principal causa de morbidade e mortalidade é o comprometimento cardíaco, que ocorre em cerca de 30% dos indivíduos infectados, representando atualmente, cerca de 2 milhões de pessoas (Cunha Neto, 1999). Os mecanismos relativos à resistência ao estabelecimento desta cardiopatia chagásica, são ainda assunto de intenso debate, havendo, entretanto, o consenso da importância da constituição genética do indivíduo, no desenvolvimento da doença. Os ensaios laboratoriais necessários à compreensão destes mecanismos genéticos, são, por razões óbvias, realizadas em modelos animais definidos geneticamente. Aspectos genéticos da resistência à infecção pelo T.cruzi. No início dos anos 80, pesquisadores investigando a resistência ao T.cruzi, em camundongos de diferentes linhagens isogênicas, concluíram que o controle da parasitemia e a capacidade de sobreviver à fase aguda da infecção dependiam de fatores genéticos, ainda não identificados, relacionados à constituição genética do parasito (Macedo & Pena, 1998; Andrade e cols, 1985) e do hospedeiro (Eksi e cols, 1996; Moulia, 1996). Com relação ao hospedeiro, os resultados obtidos por Trischmann, indicaram ser o Complexo Maior de Histocompatibilidade (H2), presente no cromossomo 17, importante para a resistência, conforme pode ser observado, analisando-se o comportamento de camundongos isogênicos das linhagens C57BL/6 e DBA/2 e seus respectivos híbridos F1 e F2 após desafio com o parasito. Conclusão semelhante foi obtida por Wrightsman e cols (1984) realizando experimentos com as linhagens C57BL/10, C57BL/6 e BALB/c. A realização de ensaios, utilizando linhagens recombinantes isogênicas (Bailey, 1971), abriu nova discussão acerca da importância de mecanismos genéticos no fenômeno da resistência ao T.cruzi. Este modelo animal é desenvolvido a partir de duas linhagens isogênicas acasaladas por pelo menos 20 gerações e, como conseqüência, os animais derivados serão homozigotos em todos os alelos, sendo entretanto, ora de uma linhagem isogênica parental original, ora da outra. Trabalhando com linhagens recombinantes isogênicas (BXH-2) derivadas do fenótipo resistente (C57BL/6) e susceptível (C3H/HeJ), Trischmann identificou que esses recombinantes eram mais susceptíveis à infecção pelo parasito, quando comparados às linhagens parentais isogênicas originais. Tal fato conduziu à hipótese da ocorrência de uma mutação, durante o processo de obtenção daquela linhagem recombinante, a qual estaria relacionada à incapacidade dos animais controlarem a proliferação do T. cruzi. Desta forma, postulou-se a hipótese da resistência ser um fenômeno de caráter poligênico, com a participação de genes localizados fora do Complexo Maior de Histocompatibilidade (Trischmann, 1984; Wrightsman e cols, 1984). Estes achados estimularam o desenvolvimento do presente trabalho, que teve como principal objetivo, identificar as regiões cromossômicas envolvidas com a resistência à cepa Y2 de T. cruzi. Para tanto, foram utilizados camundongos, oriundos de diferentes programas de acasalamento que, depois de infectados, foram analisados pela reação de polimerase em cadeia (PCR), com marcadores moleculares para microsatélites, presentes em amostras de DNA dos indivíduos que resistiram à infecção. Análise da resistência à infecção experimental pelo T.cruzi. Animais isogênicos, experimentalmente infectados, apresentam um comportamento diferenciado. Camundongos da linhagem A/J morrem, ainda na fase aguda da infecção, com um inóculo constituído de baixas quantidades de parasito (como por exemplo 10 1 formas sanguícolas de tripomastigotas), enquanto animais C57BL/6 podem sobreviver com doses elevadas, como por exemplo 10 5 formas de parasitas. A existência de linhagens isogênicas, que exibem fenótipos intermediários, sugere que o determinismo genético da resistência ao parasito está sob o efeito de um controle complexo e que, a capacidade de animais inoculados resistirem à infecção é função da expressão de genes oriundos de diferentes regiões do genoma dos animais. A identificação destas regiões, seguida de sua análise, poderá contribuir significativamente para a compreensão do fenômeno da resistência. Identificação dos cromossomos e das regiões relacionadas à resistência. Determinação da dose discriminatória Inicialmente, animais oriundos das linhagens isogênicas de fenótipo resistente (C57Bl/6) e susceptível (A/J) foram desafiados com diferentes doses de parasito, a fim de se determinar a dose discriminatória. O ensaio foi realizado inoculando-se grupos de animais, de ambas as linhagens, com 10 1 ,10 2 ,10 3 ,10 4 e10 5 formas de tripomastigostas. Todos os animais da linhagem A/J morreram com a dose de 10 1 28 <strong>Biotecnologia</strong> Ciência & Desenvolvimento - nº 29
Tabela 1: Regiões relacionadas com a resistência encontrada nos animais (B6A)F2 CROMOSSOMO MARCADOR MOLECULAR POSIÇÃO Nº DE ANIMAIS TESTADOS X 2 p CROM. 7 D7Mit27 D7Mit82 D7Mit301 D7Mit222 23 25 46,6 52,6 71 77 68 76 8,83 17,57 13,03 8,92 0,012088593 0,000152902 0,001481492 0,011556279 CROM. 11 D11Mit162 D11Mit83 D11Mit135 8 16 17 55 68 51 1,80 26,82 2,57 0,406569663 1,49742E-06 0,276840507 CROM. 14 D14Mit7 D14Mit265 44 48 77 77 3,16 19,47 0,206403543 5,92487E-05 CROM. 17 D17Mit16 D17Mit176 D17Mit66 18 22 24 37 68 64 0,89 11,41 0,38 0,640218379 0,003326341 0,82902912 CROM. 19 D19Mit40 D19Mit19 D19Mit100 25 26 27 75 77 53 2,79 18,43 6,4 0,248246436 9,96062E-05 0,040839186 parasitos e por esta razão foram considerados susceptíveis. Entretanto, o uso da maior dose administrada (10 5 parasitos) conduziu à morte de 50% da população de animais da linhagem C57Bl/6, que por esta razão foi considerada resistente. Com base nestes resultados, durante todo o experimento foi utilizado um inóculo constituído de 10 4 formas de tripomastigota sanguícola, injetado intraperitonialmente. Observou-se que somente os animais com fenótipo resistente sobrevivem, diferentemente daqueles com fenótipo susceptível ou intermediário. Análise da transmissão da resistência Para uma melhor compreensão do mecanismo de herança, presente no fenômeno da resistência, foram realizados testes em animais híbridos F1, produto do acasalamento realizado entre camundongos isogênicos C57BL/6 de fenótipo resistente e A/J de fenótipo susceptível. Uma vez que apresentam metade de cada um dos parentais isogênicos originais, resistentes e susceptíveis, estes animais são homogêneos, ou seja, têm a mesma composição genética. A sobrevivência encontrada, após o desafio com a dose discriminatória de parasito, foi similar à observada na linhagem isogênica de fenótipo resistente, indicando que a resistência à fase aguda da infecção podia ser transmitida e apresentava um caráter dominante. Identificação das regiões relacionadas com a resistência. A partir destes achados e com acasalamentos programados, foram produzidos animais recombinantes de segunda geração, (B6A)F2, (obtidos por “intercrosss” entre Tabela 2 – Regiões cromossômicas comuns a (B6A)F2r e RIS* Marcador Molecular Posição Linhagens Recombinantes Isogênicas Grupo I Grupo II BXA1 BXA7 BXA2 BXA4 D7Mit82 25 B B A A D7Mit145 26,4 B B A A D11Mit83 16 A A B A D14Mit265 48 B B B B D17Mit176 22 B B B A D19Mit19 26 B B A B <strong>Biotecnologia</strong> Ciência & Desenvolvimento - nº 29 29
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