Untitled - Biotecnologia

1993; James et al., 1993).
Uma vez conhecida a sequência
desta proteína, a sua identificação é
geralmente feita por correlação de
dados depositados em bancos acessíveis
via internet, como o da Swiss-Prot
(Suiça).
Técnicas e Opções para Análise
de Proteoma Diferencial
O proteoma diferencial compara
diferentes perfis de proteínas entre
situações de interesse. O objetivo central
do proteoma diferencial é melhorar
o conteúdo de informações do
estudo de proteoma através de análises
múltiplas. As três principais técnicas
usadas atualmente para análise de
proteoma diferencial são eletroforese
diferencial em gel (DIGE), “Multplex
Proteome” (MP) e rotulação de proteínas
com reagentes ICAT (“isotopecoded
affinity tagging”).
A técnica DIGE (Figura 4) usa ésters
de succinil de corantes de cianina,
CY2, CY3 e CY5, que podem ser
empregados para rotulação fluorescente
para três populações complexas
de proteínas antes de misturá-las e
resolvê-las simultaneamente na mesma
2DE. Recentemente, foi desenvolvido
outro procedimento similar usando
corante Alexa Fluor.
O “Multplex Proteome” (MP) baseia-se
na determinação paralela dos
níveis de expressão de proteínas bem
como em certos atributos funcionais,
tais como níveis de glicosilação, capacidade
de ligação com drogas ou metabolização
de drogas (Figura 5). Esta
tecnologia utiliza o mesmo fluoróforo
para medir proteínas através de todos
os géis no banco de dados, e emprega
fluoróforos adicionais com diferentes
excitações e/ou emissão máxima para
acentuar atributos funcionais específicos
da espécie. A vantagem desta
técnica sobre a DIGE é que ela dá uma
faixa muito mais larga de informações.
A técnica de ICAT permite identificação
sistemática das proteínas numa
mistura complexa e quantificação precisa
das diferenças em abundância de
cada proteína presente em duas ou
mais amostras protéicas. O reagente
ICAT é formado por três componentes
funcionais: um grupamento reativo
à tióis, que é seletivo para os grupamentos
sulfidrilas das cadeias laterais
de cisteínas reduzidas, um grupo de
etileno glicol que pode conter átomos
de deutério (isotopicamente pesado)
ou não (isotopicamente normal) e que
possibilita realizar quantificação precisa
por MS, e um grupamento de biotina
que é a “etiqueta de afinidade” utilizado
como base para o isolamento seletivo
dos peptídios contendo cisteína
(marcados com ICAT) de uma mistura
complexa de peptídios, através de
cromatografia de afinidade em coluna
de avidina (Figura 6).
Os resíduos de cisteína reduzida
das proteínas nas duas amostras a serem
comparadas são rotulados separadamente
durante o experimento. Em
uma das amostras é usada a forma
isotopicamente pesada e na outra
amostra a forma leve do reagente
ICAT. As duas amostras são combinadas
e digeridas com tripsina. Os peptídios
marcados, que contém cisteína
são isolados por cromatografia de afinidade
e analisados por espectrometria
de massa, determinando assim a identidade
da proteína que deu origem ao
peptídio e a abundância relativa de
cada proteína nas amostras sendo comparadas
(Figura 7) (Gygi et al., 1999).
Conclusões
A Proteômica veio para revolucionar
os estudos de Genoma, uma vez
que utiliza-se de suas ferramentas para
identificar as proteínas expressas em
situações específicas em um dado
momento naquele ambiente. A Proteômica
é dinâmica e permite fazer estudos
comparativos. Os métodos para
análise global da abundância de proteínas,
modificações pós-traducionais e
as mudanças nesses dois parâmetros
como a função de um estado biológico
da célula ou tecido se desenvolveram
utilizando-se das técnicas de eletroforese,
cromatografia e espectrometria
de massa como componentes-chave
para o estabelecimento de plataformas
de estudo. As inovações tecnológicas
na detecção, análise e quantificação
de proteínas acelerou rapidamente
o desenvolvimento da Proteômica
nos últimos 4 anos. Isso, sem dúvida,
ocorreu devido ao foco que instituições
privadas e públicas deram à
pesquisa do Genoma ao Proteoma.
No Brasil, a Proteômica vem se desenvolvendo
desde o início do Projeto
Genoma da Xyllela fastidiosa financiado
pela Fundação de Amparo a
Pesquisa do Estado de São Paulo (FA-
PESP). Diversos grupos inseridos no
Genoma Funcional da FAPESP ainda
continuam trabalhando com técnicas
proteômicas com o objetivo de mapear
as proteínas funcionais importantes
no estabelecimento da doença
do “amarelinho”e a sobrevivência da
bactérianaslaranjeirasvariedadedoce.
Com os resultados obtidos destes estudos
espera-se criar estratégias de
controle desta doença, a qual já tem
causado sérios danos à citricultura
paulista.
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164 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 29