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que 62% de similaridade. As seqüências que ultrapassam este limite são mescladas, e participam da definição da matriz como se fossem uma única seqüência. Alinhamento global e local Quanto à região analisada, o alinhamento de seqüências pode ser grosseiramente classificado em dois tipos, o alinhamento global e o alinhamento local. No alinhamento global, as seqüências envolvidas devem ser alinhadas de um extremo ao outro, dando origem a apenas um resultado. Já no alinhamento local, procura-se alinhar apenas as regiões mais conservadas, independente da localização relativa de cada região em sua seqüência. Consequentemente, este alinhamento tem como resultado uma ou mais regiões conservadas entre as seqüências. O alinhamento global é freqüentemente utilizado para determinar regiões mais conservadas de seqüências homólogas. Exemplo de programas que utilizam este alinhamento são ClustalW e Multialin. O alinhamento local é geralmente utilizado na procura por seqüências homólogas ou análogas (funcionalmente semelhantes) em banco de dados. O algoritmo utilizado pelo programa BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) realiza este tipo de alinhamento. BOX4 - Softwares mais utilizados para o alinhamento de seqüências ClustalW http://www.ebi.ac.uk/clustalw/index.html Versão web de um dos programas de alinhamento múltiplo mais utilizados (Clustal). Fornece ao usuário uma grande quantidade de parâmetros e de saídas diferentes. Possui interface gráfica onde os alinhamentos podem ser visualizados de forma agradável e alterados. Multialinhttp://prodes.toulouse.inra.fr/multalin/multalin.html Programa de alinhamento múltiplo bastante conhecido. Fácil e rápido. Fastahttp://www.ebi.ac.uk/fasta33/ Precursor dos programas de alinhamento. Promove serviço de busca em banco de dados de ácidos nucléicos e proteínas. BLAST, BLAST2sequences http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ BLAST é o programa de alinhamento mais utilizado no mundo. Realiza a busca por seqüências homólogas em banco de dados de ácidos nucléicos e proteínas. O programa BLAST2sequences consiste no algoritmo BLAST para alinhamento de duas seqüências. 16 <strong>Biotecnologia</strong> Ciência & Desenvolvimento - nº 29 Figura 4: Exemplos de alinhamento global e local. No alinhamento global as seqüências são alinhadas do início ao fim, já no alinhamento local alinha-se as subseqüências conservadas Projetos genoma e transcriptoma Grande parte dos bioinformatas modernos trabalha com dados de projetos genoma ou transcriptoma. Em projetos genoma adota-se a abordagem de fragmentar todo o genoma de um organismo em pequenos pedaços e de seqüenciar tais pedaços, utilizando programas computacionais para montá-los e reconstituir a informação genômica inicial. Essa estratégia é adotada principalmente devido à restrição do tamanho da seqüência que pode ser lida nos seqüenciadores. Mesmo os mais modernos conseguem ler apenas cerca de 1000 pares de base em cada corrida. Em projetos genomas de procariotos, normalmente realiza-se a quebra do DNA inteiro do organismo desejado em fragmentos pequenos (através da técnica de shotgun) que são clonados em vetores plasmidiais que serão seqüenciados em suas extremidades. Após uma primeira etapa de montagem desse genoma, fragmentos maiores são clonados em cosmídeos e seqüenciados. Essa segunda etapa é importante para a montagem do genoma completo do organismo, já que a primeira normalmente produz uma seqüência incompleta, apresentando alguns buracos de seqüência (gaps). Já em projetos genomas de organismos eucariotos, que possuem freqüentemente uma enorme quantidade de DNA, normalmente prefere-se adotar uma técnica conhecida como shotgun hierárquico. Nessa técnica, o DNA inteiro do organismo é primeiramente inserido em grandes vetores de clonagem, como cromossomos artificiais de bactérias (BACs) ou de leveduras (YACs). Depois então é realizado um shotgun desses grandes fragmentos dos vetores, gerando fragmentos menores que são agora clonados em vetores plasmidiais para o sequenciamento. Portanto, tais projetos consistem de duas etapas, a montagem de cada um dos grandes fragmentos clonados nos BACs e YACs e a montagem final que reunirá as seqüências completas dos BACs e YACs montados para a reconstituição da informação genômica inicial.
Figura 5. a) Na estratégia de shotgun, todo o DNA genômico de um organismo é fragmentado em pequenos pedaços (1), que são clonados em vetores de pequeno porte, como plasmídeos, para o posterior seqüenciamento. b) Na estratégia de shotgun hierárquico, normalmente utilizada para grandes genomas, realizam-se dois passos. (1) Primeiramente fragmenta-se o genoma em grandes pedaços, que são clonados em vetores de grande porte, como BACs ou YACs. (2) Posteriormente realiza-se uma segunda etapa de shotgun, onde as seqüências contidas nesses vetores são fragmentadas em pequenos pedaços e clonadas em vetores de pequeno porte, que serão sequenciados Muitas vezes, ao invés de ser realizado o seqüenciamento genômico de um organismo eucarioto, prefere-se realizar o seqüenciamento só das regiões gênicas, utilizando informações oriundas de RNA mensageiro (mRNA). Dessa forma é realizada uma biblioteca de cDNA, representando o conjunto de mRNAs de uma célula, que são clonados em vetores plasmidiais. Os insertos de cDNA presentes em tais vetores são então seqüenciados a partir de suas extremidades 5’ ou 3’, produzindo pequenas seqüências que irão representar pedaços dos genes expressos no momento da extração do mRNA da célula em questão. Esses pedaços seqüenciados representam etiquetas de genes expressos, ou ESTs (Expressed Sequence Tags) e uma análise dos genes expressos é uma abordagem bastante utilizada na tentativa de entender o funcionamento do metabolismo dos mais diversos organismos. Como exemplo, no Brasil abordagens transcriptômicas já foram utilizadas em larga escala no projeto da canade-açúcar e vêm sendo utilizados em organismos parasitas, como é o caso dos projetos de seqüenciamento de ESTs de Schistosoma mansoni em São Paulo e em Minas Gerais. Como já foi mencionado anteriormente, normalmente adota-se a estratégia de seqüenciamento genômico em organismos cujo genoma é pequeno e que contém baixa quantidade de seqüências repetitivas. Entretanto, a estratégia de seqüenciamento do transcriptoma, ou a produção de ESTs, não é utilizada apenas quando o genoma do organismo é muito grande. Essa estratégia é importante também para estudar o desenvolvimento dos organismos, produzindo bibliotecas de diferentes fases de desenvolvimento e observando quais genes são expressos em cada momento. Tal abordagem também é importante para estudarmos como ocorre a expressão diferencial de genes em diferentes órgãos de um mesmo organismo, para que possamos entender a função desses órgãos ou como eles realizam funções conhecidas. Portanto podemos dizer que as estratégias de seqüenciamento de genomas e transcriptomas são complementares e ambas devem ser realizadas, quando possível, para que possamos obter informações relevantes sobre os organismos que estamos estudando. Base calling Os dados brutos provenientes do seqüenciador de DNA são normalmente submetidos diretamente a algum programa de base calling. Obase calling consiste no processo de leitura dos dados do seqüenciador e identificação da seqüência de DNA gerada, atribuindo ainda um valor de qualidade para cada posição nucleotídica identificada. Normalmente cada seqüenciador apresenta um programa de base callingassociado. Entretanto, o programa mais utilizado nessa etapa é o PHRED. O PHRED reconhece dados de seqüências a partir de arquivos SCF (Standard Chomatogram Format), arquivos de cromatograma dos analisadores automáticos de DNA ABI e arquivosMegaBA- CE ESD. Este software reconhece a seqüência de nucleotídeos a partir do arquivo de dados brutos do seqüenciador, atribui valores de qualidade às bases constituintes da seqüência nucleotídica e gera arquivos de saída contendo informações sobre o base call e os valores de qualidade. O valor de qualidade das seqüências analisadas pode ser encontrado nos arquivos FASTA e PHD. De acordo com Ewing et al (1998) as atribuições seguras de valores às seqüências nucleotídicas são proporcionadas pela implantação de um algoritmo que tem como base os métodos de Análise de Fourier. O algoritmo analisa as quatro bases e prediz a provável região central dos picos e as distâncias relativas entre os picos da seqüência de DNA. O valor de qualidade atribuído a cada base é obtido pela fórmula a seguir, que calcula a probabilidade de erro no basecall, onde o Pe é a probabilidade de uma base estar errada. PHRED Quality = -10 log (Pe) As pontuações inseridas nos arquivos de saída do PHRED representam a probabilidade logarítmica negativa em escala de erro de um base call; portanto, quanto maior o valor de qualidade do PHRED, menor a probabilidade de ter ocorrido um erro. Só como exemplo, um valor de PHRED 20 para uma determinada posição nucleotídica significa que ela apresenta uma chance em 100 de estar errada. Já um valor de PHRED 30 significa que determinada base apresenta uma chance em 1000 de ter havido um erro no base calling. Esses valores são importantes para determinar se uma região precisa ser resseqüenciada. Mascaramento de vetores A estratégia freqüentemente adotada após a realização do base calling éa <strong>Biotecnologia</strong> Ciência & Desenvolvimento - nº 29 17
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